人肺癌細(xì)胞中TSLC1基因表達(dá)缺失與DNA甲基化的相關(guān)性研究

明樹紅* 高靜* 孫鐵英

肺癌是當(dāng)今世界上發(fā)病率與死亡率極高的惡性腫瘤之一。由于缺乏有效的早期診斷方法，臨床診斷的肺癌多為進(jìn)展期，而且療效很不理想。因此肺癌的早期診斷和治療成為臨床上一大難題。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，癌癥的基因發(fā)病機(jī)制研究、基因診斷和基因治療受到大家的關(guān)注，特別是表觀遺傳（epigenetic）調(diào)控的研究成為目前癌癥研究的熱點。早在1989年就已報道肺癌細(xì)胞中常存在DNA甲基化狀態(tài)的改變[1]，而DNA異常甲基化是一種非基因水平改變的表觀遺傳調(diào)控方式[2]。這種現(xiàn)象不僅可以激活某些原癌基因的表達(dá)，而且可抑制一些抑癌基因的轉(zhuǎn)錄。

TSLC1（tumor suppressor in lung cancer 1）又名NECL2（nectin-like molecule 2），是正常人體組織廣泛表達(dá)的免疫球蛋白樣細(xì)胞粘附分子，因最初發(fā)現(xiàn)其在肺癌組織中表達(dá)缺失而命名為TSLC1，后因其具有細(xì)胞粘附的功能而命名為CADM1（cell adhesion molecule 1）。TSLC1是由442個氨基酸組成的一種膜蛋白，在細(xì)胞粘附、突觸形成、腫瘤抑制等功能中發(fā)揮重要作用。最近幾項研究[3-5]同時表明敲除TSLC1可以引起雄性小鼠不育，Evi Michels等[6]報道TSLC1很可能是神經(jīng)母細(xì)胞瘤的抑癌基因，最新的一項研究[7]表明TSLC1是靜脈血栓形成的危險因子。迄今為止，對TSLC1研究最多的是其在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的功能及其表達(dá)下調(diào)的機(jī)制，如TSLC1在肺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、鼻咽癌、乳腺癌、宮頸癌、腦膜瘤等組織中表達(dá)明顯下降或失活，被認(rèn)為是一種抑癌基因[8-22]。在對TSLC1在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)原因的探索[10]中發(fā)現(xiàn)，突變失活不是其表達(dá)下調(diào)的主要原因，而TSLC1啟動子區(qū)甲基化是一個頻發(fā)事件，與TSLC1的表達(dá)下調(diào)呈相關(guān)性，用去甲基化試劑5-氮-2-脫氧胞苷（5-Aza-2-deoxycytidine, 5-Aza-dC）處理腫瘤細(xì)胞系后，TSLC1的表達(dá)水平可恢復(fù)正常，這些結(jié)果均提示TSLC1啟動子區(qū)的甲基化可能是導(dǎo)致TSLC1表達(dá)下調(diào)的主要原因。為了明確探討肺癌細(xì)胞系中TSLC1的表達(dá)水平及其啟動子區(qū)的甲基化水平，本研究采用RTPCR及Real-time PCR方法檢測TSLC1在人正常肺組織和3株肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平，并運用bisulfite sequencing方法對TSLC1啟動子區(qū)的甲基化水平進(jìn)行檢測，根據(jù)去甲基化試劑處理肺癌細(xì)胞系前后TSLC1的表達(dá)變化，判斷TSLC1在肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平是否與其啟動子區(qū)的甲基化水平呈相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織與細(xì)胞系 人正常肺組織由北京醫(yī)院胸外科提供，3株肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、NCI-H446、Calu-3及100×雙抗、0.25%胰酶購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心，細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基McCOy-5A、RPMI-1640、MEM/NEAA及胎牛血清購自Gibco公司。

1.1.2 試劑、耗材及引物 RNA抽提用Trizol購自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄酶（RT酶）購自Biolab公司，Taq酶、Realtime PCR反應(yīng)試劑購自TaKaRa公司。亞硫酸氫鹽、氫醌及5-Aza-dC購自Sigma公司?；蚪M提取試劑盒購自QIAGEN公司，DNA片段回收試劑盒、pGEM-T載體購自Promega公司。文中所用引物由Invitrogen公司合成，引物序列詳見表1。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌細(xì)胞系用含10%胎牛血清和雙抗（青霉素、鏈霉素各100 U/mL）的培養(yǎng)基，在37oC、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，根據(jù)實驗需要收取細(xì)胞。

1.2.2 5-Aza-dC處理肺癌細(xì)胞系 5-Aza-dC粉末用DMSO配置成20 mmol/L的母液，分裝后存至-70oC。藥物處理前1天接種細(xì)胞于60 mm培養(yǎng)皿中，接種細(xì)胞數(shù)以第2天細(xì)胞長至密度約20%為宜。第2天細(xì)胞換取新培養(yǎng)基，并向培養(yǎng)基中加入5-Aza-dC至終濃度10 μmol/L，此后每天換液加藥1次，連續(xù)藥物處理5天后，收取細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.3 RT-PCR及Real-time PCR檢測 按Invitrogen公司的說明書用Trizol一步法提取組織或細(xì)胞RNA，測量RNA濃度后，按Biolab公司說明書用RT酶將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。半定量RT-PCR反應(yīng)條件為：94oC預(yù)變性5 min；94oC、30 s，55oC、30 s，72oC、35 s，反應(yīng)25個循環(huán)；72oC充分延伸10 min，4oC終止反應(yīng)，產(chǎn)物用2%瓊脂糖進(jìn)行電泳。Real-time PCR反應(yīng)條件為94oC預(yù)變性10 s，94oC變性5 s，60oC退火34 s，進(jìn)行45個循環(huán)后終止，結(jié)果運用Realtime PCR儀自帶軟件進(jìn)行分析。

表 1 本研究所用引物序列Tab 1 The primer sequences used in this study

1.2.4 Bisulfite sequencing 實驗步驟按文獻(xiàn)[23]進(jìn)行，修飾后genome用作PCR模板?；厥蘸蟮腜CR產(chǎn)物連接到pGEM-T載體上，每種樣品挑選11個陽性克隆送測序。

1.3 CpG島分析軟件及統(tǒng)計學(xué)處理 運用歐洲生物信息學(xué)研究所（EBI）提供的軟件（http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/）分析TSLC1基因5'非編碼區(qū)的CpG島。所有實驗至少重復(fù)3次，實驗數(shù)據(jù)以統(tǒng)計學(xué)分析軟件SPSS 12.0進(jìn)行統(tǒng)計處理。采用Student's t-test比較結(jié)果，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TSLC1在正常肺組織和肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)譜 半定量RT-PCR及Real-time PCR檢測結(jié)果均表明，TSLC1在正常肺組織及肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中有表達(dá)，而在其它2株肺癌細(xì)胞系NCI-H446及Calu-3中表達(dá)明顯下降或失活（圖1A，圖1B）。

2.2 TSLC1基因5'非編碼區(qū)CpG島分布 將TSLC1基因5'非編碼區(qū)約3 500 bp序列在CpG島分析軟件中進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在所分析的序列中存在一個CpG島，它主要分布于翻譯起始位點ATG附近約800 bp的區(qū)域內(nèi)（圖2）。

2.3 TSLC1啟動子區(qū)在正常肺組織和肺癌細(xì)胞系中的甲基化譜式 我們選取文獻(xiàn)報道的與TSLC1表達(dá)下調(diào)密切相關(guān)的序列（TSLC1啟動子區(qū)-556 bp到-336 bp之間的序列，翻譯起始位點的“A”定義為+1）進(jìn)行bisulfite sequencing檢測，結(jié)果表明被檢測的TSLC1啟動子區(qū)在正常肺組織和A549細(xì)胞中呈非甲基化狀態(tài)（圖3A，圖3B），而在NCI-H446及Calu-3細(xì)胞中呈高甲基化狀態(tài)（圖3C，圖3D）。

2.4 5-Aza-dC處理癌細(xì)胞前后TSLC1的表達(dá) 10 μmol/L的5-Aza-dC處理肺癌細(xì)胞系前后的Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，5-Aza-dC處理A549細(xì)胞后TSLC1的表達(dá)未明顯提高（圖4A），而5-Aza-dC處理NCI-H446和Calu-3細(xì)胞后TSLC1的表達(dá)得到明顯提高（圖4B，圖4C）。

圖 1 TSLC1在正常人肺組織及肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)譜。半定量RT-PCR方法（A）及Real-time PCR方法（B）檢測TSLC1在人正常肺組織及3株肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平，GAPDH作為內(nèi)對照。Fig 1 Expression pattern of TSLC1 in human normal lung tissue and lung cancer cell lines. Expression levels of TSLC1 in human normal lung tissue and three lung cancer cell lines by semi-quantitative RTPCR (A) and Real-time PCR (B), GAPDH used as endogenous control.

圖 2 TSLC1基因5'非編碼區(qū)的CpG島分布。圖下方的每條豎線代表一個CpG二核苷酸，藍(lán)色區(qū)域代表CpG島，翻譯起始位點的“A”定義為+1。Fig 2 The distribution of CpG island in 5'non-coding region of TSLC1 gene. Each vertical short stick at the bottom of figure indicates one CpG dinucleotide, the blue region represents the CpG island and the translation start site "A" as +1.

3 討論

人TSLC1為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所袁建剛教授實驗室首次分離克隆的基因，定位于染色體11q23.12，編碼一種人體組織廣泛表達(dá)的由442個氨基酸組成的跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族一員。TSLC1作為抑癌基因，在多種腫瘤中表達(dá)下降或失活，研究表明突變失活不是其表達(dá)下調(diào)的主要原因，而TSLC1啟動子區(qū)甲基化是一個頻發(fā)事件，與TSLC1的表達(dá)下調(diào)呈相關(guān)性。本研究應(yīng)用RT-PCR、Real-time PCR及bisulfite sequencing方法檢測了TSLC1在3種肺癌細(xì)胞中的表達(dá)與其啟動子區(qū)甲基化的關(guān)系。結(jié)果顯示TSLC1在正常肺組織和A549細(xì)胞中表達(dá)，而在NCI-H446和Calu-3細(xì)胞中表達(dá)缺失。運用軟件對人TSLC1啟動子區(qū)進(jìn)行分析表明，TSLC1啟動子區(qū)存在一個CpG島，因此我們運用bisulfite sequencing方法檢測了正常肺組織和肺癌細(xì)胞系中TSLC1啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)，結(jié)果表明在表達(dá)TSLC1的正常肺組織和A549細(xì)胞中，其啟動子區(qū)未發(fā)生甲基化，而在TSLC1缺失表達(dá)的NCI-H446及Calu-3細(xì)胞中，其啟動子區(qū)發(fā)生了高甲基化。我們用甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-dC處理肺癌細(xì)胞，用Real-time PCR方法檢測處理前后TSLC1的表達(dá)水平，結(jié)果表明5-Aza-dC處理A549細(xì)胞前后，TSLC1的表達(dá)水平無明顯變化，而5-Aza-dC處理NCI-H446及Calu-3細(xì)胞后，TSLC1的表達(dá)水平明顯提高。上述結(jié)果具有很好的關(guān)聯(lián)性，5-Aza-dC處理啟動子未發(fā)生甲基化、表達(dá)TSLC1的肺癌細(xì)胞后，TSLC1的表達(dá)水平無明顯改變，但5-Aza-dC處理啟動子發(fā)生高甲基化、TSLC1缺失表達(dá)的肺癌細(xì)胞后，TSLC1的表達(dá)水平明顯提高。這說明在TSLC1缺失表達(dá)的肺癌細(xì)胞中，TSLC1啟動子的甲基化是引起其表達(dá)失活的機(jī)制之一。

圖 3 TSLC1在1例正常肺組織和3株肺癌細(xì)胞系中的甲基化譜式。A、B、C、D分別代表正常肺組織、A549細(xì)胞、NCI-H446細(xì)胞和Calu-3細(xì)胞中TSLC1啟動子區(qū)的甲基化模式。每個圖頂端的每條豎線代表一個CpG二核苷酸，被檢測的TSLC1啟動子區(qū)位于TSLC1基因組的-556 bp到-336 bp處，翻譯起始位點的“A”定義為+1。被檢測的TSLC1啟動子區(qū)共包括11個CpG二核苷酸，其中標(biāo)記為1號-6號的CpG位點是文獻(xiàn)報道的重點檢測位點。黑色圓圈表示發(fā)生甲基化的CpG；白色圓圈表示未發(fā)生甲基化的CpG。Fig 3 Methylation pattern of TSLC1 in one human normal lung tissue and three lung cancer cell lines. A, B, C, D represented the methylation pattern of TSLC1 promoter in normal lung tissue, A549, NCI-H446 and Calu-3 cell lines, respectively. Each vertical short stick at the top of each figure indicates one CpG dinucleotide, and TSLC1 promoter region detected is located from -556 bp to -336 bp with the translation start site "A" as +1.Eleven CpG sites were included in this fragment and CpG sites which are marked from 1 to 6 are very important according to the papers. Black dot means methylated CpG while white dot means non-methylated CpG.

圖 4 TSLC1在5-Aza-dC處理肺癌細(xì)胞系前后的表達(dá)譜。A、B、C分別代表TSLC1在5-Aza-dC處理A549細(xì)胞、NCI-H446和Calu-3細(xì)胞前后的表達(dá)水平；與對照組相比，*P＜0.05。Fig 4 Expression pattern of TSLC1 in lung cancer cell lines before and after the treatment of 5-Aza-dC. A, B,C represented the expression level of TSLC1 in A549,NCI-H446 and Calu-3 cell lines before and after the treatment of 5-Aza-dC, respectively; *P＜0.05 compared with control.

在本研究中，我們運用RT-PCR及Real-time PCR方法檢測了TSLC1轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，因?qū)嶒炦M(jìn)行時尚無商品化TSLC1抗體，自制的TSLC1抗體特異性差，故而無法從蛋白水平檢測其表達(dá)，此外，5-Aza-dC通過抑制mRNA轉(zhuǎn)錄進(jìn)而影響蛋白表達(dá)，而且大多數(shù)研究均從RNA水平檢測5-Aza-dC處理前后目的基因的變化，因此本研究結(jié)果具有一定的說服力，若有條件從蛋白水平檢測TSLC1的表達(dá)及藥物處理前后的變化會更有意義。該研究的前期實驗結(jié)果表明，TSLC1在人正常肺組織中高表達(dá)，而且其它研究也表明TSLC1在正常肺組織中高表達(dá)，在肺癌組織中表達(dá)缺失，因此本研究選取取材方便的正常肺組織作為陽性對照以判斷肺癌細(xì)胞系是否表達(dá)TSLC1。本文是從細(xì)胞水平對TSLC1的表達(dá)缺失與甲基化關(guān)系進(jìn)行了初步探討，若能選取正常肺細(xì)胞作為陽性對照，本文的前后一致性會更強。我們選取的細(xì)胞系中，A549及Calu-3是肺腺癌細(xì)胞系，NCI-H446是小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系，3種細(xì)胞系中TSLC1的表達(dá)及甲基化譜不一致，可能與不同來源的肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為有關(guān)。3種細(xì)胞均具有致瘤能力，但它們在腫瘤發(fā)生過程中表現(xiàn)出的生物學(xué)行為尚不清楚，有待深入研究。

表觀遺傳調(diào)控是目前基因組學(xué)研究的熱點，包括DNA甲基化、組蛋白乙?；⒎核鼗癿iRNA調(diào)控等。組蛋白去乙酰化也是導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的機(jī)制之一[24]，而且常與DNA甲基化協(xié)同作用抑制基因表達(dá)[25]。miRNA是目前研究基因表達(dá)調(diào)控的熱門領(lǐng)域，通過靶向作用于目的基因而抑制基因的轉(zhuǎn)錄[26]。本文從DNA甲基化入手研究其與TSLC1表達(dá)的關(guān)系，因為已有研究證實在多種腫瘤中DNA高甲基化是引起TSLC1表達(dá)失活的主要機(jī)制，因此本文結(jié)果從這一方面證明DNA高甲基化是抑制TSLC1在肺癌細(xì)胞中表達(dá)失活的機(jī)制之一?；虮磉_(dá)調(diào)控是一個很復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，是否還有其它機(jī)制引起TSLC1在肺癌中的表達(dá)缺失尚需深入研究。

雖然我們的實驗結(jié)果表明TSLC1啟動子區(qū)的甲基化可導(dǎo)致基因表達(dá)的明顯下降，但TSLC1啟動子區(qū)甲基化造成轉(zhuǎn)錄失活的具體機(jī)制仍不清楚，有待后續(xù)研究。例如，我們可以通過電泳遷移率變動分析實驗或染色質(zhì)免疫共沉淀實驗來探尋與之相結(jié)合的甲基化CpG結(jié)合蛋白，以此尋找線索。此外，導(dǎo)致腫瘤中TSLC1啟動子區(qū)高甲基化的機(jī)制亦不清楚，亟待我們進(jìn)一步研究。