注射用燈盞花素細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法研究

王 璐，張紅宇，劉 勤（云南省食品藥品檢驗(yàn)所，昆明市 650031）

注射用燈盞花素細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法研究

王 璐＊，張紅宇，劉 勤（云南省食品藥品檢驗(yàn)所，昆明市 650031）

目的：建立注射用燈盞花素細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法。方法：按2005年版《中國藥典》（一部）要求，采用凝膠法和光度測(cè)定法，確定合理的注射用燈盞花素內(nèi)毒素限值（L），并研究注射用燈盞花素對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素與鱟試劑反應(yīng)的干擾情況，以確定無干擾試驗(yàn)濃度。結(jié)果：L＝1 EU·mg-1，注射用燈盞花素的無干擾濃度為0.25 g·L-1。結(jié)論：該藥品采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法代替熱原檢查法，方法可行。

注射用燈盞花素；細(xì)菌內(nèi)毒素；凝膠法；光度測(cè)定法

燈盞花素是從菊科植物燈盞細(xì)辛的干燥全草中分離得到的野黃芩苷，為注射用燈盞花素的原料藥，以野黃芩苷計(jì)其純度應(yīng)達(dá)到98%以上[1]。注射用燈盞花素具有活血化瘀、通絡(luò)止痛的功效，臨床常用于中風(fēng)后遺癥、冠心病、心絞痛的治療。云南省食品藥品檢驗(yàn)所承擔(dān)了國家評(píng)價(jià)抽驗(yàn)注射用燈盞花素的檢驗(yàn)及探索性研究任務(wù)。在2005年版《中國藥典》增補(bǔ)本中，注射用燈盞花素細(xì)菌內(nèi)毒素值用熱原檢查法控制，該法用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物家兔進(jìn)行，為一傳統(tǒng)方法。用鱟試劑（TAL）進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法與之比較，具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、標(biāo)準(zhǔn)化試驗(yàn)過程短，且可完成多批次供試品檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)，國家鼓勵(lì)以合理的試劑取代實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用。因此，筆者按照2005年版《中國藥典》（一部）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[2]，對(duì)注射用燈盞花素的熱原檢查轉(zhuǎn)化為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查進(jìn)行了研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

DHG-9075A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；ZH-2型旋渦混合器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；SUB 28型恒溫水浴箱（美國格蘭特公司）；BET-32M型細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）。

1.2 試藥

1.2.1 TAL 湛江博康海洋生物有限公司，批號(hào)：0901190（λ＝0.5 EU·mL-1）、0902270（λ＝0.25 EU·mL-1），規(guī)格均為每支0.1 mL；湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)：0908281（λ＝0.5 EU·mL-1，規(guī)格：每支0.1 mL）、0907102（檢測(cè)范圍：10～0.03 EU·mL-1，規(guī)格：每支1.25 mL）。

1.2.2 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（WBET） 湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)：0902170、0908030，規(guī)格均為每支50 mL；湛江博康海洋生物有限公司，批號(hào)：W2003-3，規(guī)格：每支10 mL。

1.2.3 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（WSE） 中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：200861，規(guī)格：每支150 EU。

1.2.4 注射用燈盞花素 衡陽恒生制藥有限公司，批號(hào)：20071003（規(guī)格：10 mg）、20090408（規(guī)格：20 mg）、20081210（規(guī)格：50 mg）；昆明龍津藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20090210-2（規(guī)格：10 mg）、20090106-1（規(guī)格：25 mg）、20081124（規(guī)格：50 mg）。

2 方法與結(jié)果

2.1 凝膠法

2.1.1 TAL靈敏度復(fù)核[2]按2005年版《中國藥典》（一部）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法“TAL靈敏度復(fù)核試驗(yàn)”規(guī)定進(jìn)行檢查。結(jié)果，TAL靈敏度的測(cè)定值（λc）均在0.5λ～2λ之間，所用TAL均可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。TAL靈敏度復(fù)核結(jié)果見表1（表中，+表示凝膠形成；-表示凝膠未形成）。

表1 TAL靈敏度復(fù)核結(jié)果Tab 1 TALsensitivity check results

2.1.2 細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）的確定 本品臨床用法為肌肉注射及靜脈滴注，最大用量為1次20～50 mg，用500 mL10%葡萄糖注射液稀釋后使用，1日1次。因此，計(jì)算靜脈給藥的L時(shí)還應(yīng)考慮扣除大輸液的細(xì)菌內(nèi)毒素值，故L＝K/M＝（5 EU·kg-1·h-1－250 EU·（60 kg）-1）·h-1/（50 EU·（60 kg）-1·h-1＝1 EU·mg-1。

2.1.3 最小有效稀釋濃度（MVC）的計(jì)算[3]按公式MVC＝λ/L計(jì)算（L＝1 EU·mg-1，MVC以EU·mL-1表示）。目前，常用TAL最高λ為0.031 25 EU·mL-1，則試驗(yàn)時(shí)注射用燈盞花素的MVC為0.031 25 g·L-1。

2.1.4 干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn) 用WBET對(duì)2批注射用燈盞花素進(jìn)行溶解稀釋，使稀釋濃度為2、1、0.5、0.25、0.125 g·L-1，取相應(yīng)濃度樣品稀釋液加入WSE，制成內(nèi)毒素濃度為1、0.062 5、0 EU·mL-1的供試品溶液，取TAL（批號(hào)：0901190）與上述系列溶液進(jìn)行反應(yīng)，每一濃度重復(fù)試驗(yàn)2管。結(jié)果，供試品溶液≥0.5 g·L-1濃度管加入1 EU·mL-1WSE的各試驗(yàn)管均呈陽性，其余各試驗(yàn)管均呈陰性，表明本品濃度≤0.5 g·L-1即可能對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素與TAL的反應(yīng)無干擾作用，故筆者選擇了0.25 g·L-1的濃度進(jìn)行正式干擾試驗(yàn)。干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果見表2（表中，+表示凝膠形成；-表示凝膠未形成）。

2.1.5 正式干擾試驗(yàn)[2]按2005年版《中國藥典》（一部）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法“供試品干擾試驗(yàn)”項(xiàng)下規(guī)定進(jìn)行，將2個(gè)廠家各3批注射用燈盞花素分別用WBET制成0.25 g·L-1的供試品溶液，用WBET及0.25 g·L-1的供試品溶液將WSE配成濃度為2 λ、λ、0.5λ、0.25λ的試驗(yàn)液，用2個(gè)廠家的TAL進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果，Es均在0.5λ～2λ范圍內(nèi)，且Et也均在0.5Es～2Es范圍內(nèi)，即0.25 g·L-1供試品濃度對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素與TAL的反應(yīng)無干擾作用（Es、Et表示反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值）。正式干擾試驗(yàn)結(jié)果見表3、表4（表中，+表示凝膠形成，-表示凝膠未形成）。

表2 干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果Tab 2 Interference pretest results

表3 正式干擾試驗(yàn)結(jié)果（TAL批號(hào)：0908281）Tab 3Results of interference test（TALno.0908281）

表4 正式干擾試驗(yàn)結(jié)果（TAL批號(hào)：0902270）Tab 4Results of interference test（TALno.0902270）

2.2 光度測(cè)定法

2.2.1L的確定 按“2.1.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2.2 MVC的計(jì)算 按“2.1.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2.3 檢測(cè)波長的確定 注射用燈盞花素溶解后為黃色澄明液體，細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀有2種波長可供選擇（450 nm、660 nm）。因黃色物質(zhì)對(duì)檢測(cè)光的吸收小，故筆者選擇660 nm為檢測(cè)波長。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn) 把WSE稀釋為0.24、0.12、0.06、0.03 EU·mL-14個(gè)濃度的溶液，制備4個(gè)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果，r＞0.98、變異系數(shù)＜10%時(shí)符合要求。用WBET稀釋注射用燈盞花素至0.5、0.25、0.125 g·L-1，加入中間濃度為0.12 EU·mL-1的內(nèi)毒素溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，摸索供試品溶液在什么濃度下加樣回收率最為理想。結(jié)果，回收率均在75%～125%之間，獲得了較為理想的回收率；各稀釋濃度下，樣品細(xì)菌內(nèi)毒素含量均＜1 EU·mg-1，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查均符合規(guī)定，表明可將注射用燈盞花素在660 nm波長處用光度測(cè)定法進(jìn)行試驗(yàn)。細(xì)菌內(nèi)毒素光度測(cè)定法試驗(yàn)結(jié)果見表5（表中，#表示內(nèi)毒素低于檢測(cè)限。TAL批號(hào)：0907102）。

3 討論

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是用TAL與細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝聚反應(yīng)，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素是否符合規(guī)定的一種方法。目前，《美國藥典》絕大多數(shù)品種已完成內(nèi)毒素檢查替代熱原檢查的修訂。英國、日本也正在收集這一替代過程數(shù)據(jù)，我國也在加速進(jìn)行試驗(yàn)研究，以建立更多藥品注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法。

表5 細(xì)菌內(nèi)毒素光度測(cè)定法試驗(yàn)結(jié)果Tab 5 Photometric technical test Results

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法在2005年版《中國藥典》（一部）中收載有凝膠法和光度測(cè)定法2種。凝膠法是一限量試驗(yàn)，操作簡便，主要為檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)判定供試品細(xì)菌內(nèi)毒素限值是否合格的檢驗(yàn)手段。光度測(cè)定法是一定量試驗(yàn)，主要為藥品生產(chǎn)企業(yè)采用，可定量測(cè)定供試品中含有的細(xì)菌內(nèi)毒素值，以提高生產(chǎn)質(zhì)量。注射用燈盞花素目前只有衡陽恒生制藥有限公司和昆明龍津藥業(yè)股份有限公司2個(gè)生產(chǎn)廠家，筆者對(duì)國家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)中2個(gè)廠家不同規(guī)格的6批樣品，使用不同生產(chǎn)廠家和不同靈敏度的TAL進(jìn)行了干擾試驗(yàn)。結(jié)果表明，高濃度注射用燈盞花素對(duì)于TAL與細(xì)菌內(nèi)毒素的凝集反應(yīng)有干擾（抑制）作用，經(jīng)稀釋后可以排除；濃度為0.25 g·L-1以野黃芩苷計(jì)的注射用燈盞花素對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素與TAL的反應(yīng)無干擾作用。除采用凝膠法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，亦可在660 nm波長處用光度測(cè)定法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。筆者對(duì)衡陽恒生制藥有限公司的3批樣品采用光度測(cè)定法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，昆明龍津藥業(yè)股份有限公司的3批樣品采用凝膠法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，所有檢查結(jié)果與熱原檢查結(jié)果一致，均符合規(guī)定。結(jié)果表明，該藥采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法代替熱原檢查法，方法可行。

[1]國家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國藥典（增補(bǔ)本）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：6.

[2]國家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：附錄79.

[3]唐元泰.關(guān)于注射劑細(xì)菌內(nèi)毒素檢查限值的確定[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2003，4（4）：5.

Study on Bacterial Endotoxin Test for Breviscapine for Injection

WANG Lu，ZHANG Hong-yu，LIU Qin（Yunnan Institute for Food and Drug Control，Kunming 650031，China）

OBJECTIVE：To develop bacterial endotoxin test for breviscapine for injection.METHODS：The limit of bacterial endotoxin（L）in this product was confirmed according to the appendix Ⅰ ofChinese Pharmacopoeia（2005 edition）.We had studied the interference to bacterial endotoxin test by breviscapine for injection in order to confirm the noninterference concentration with gel clot techniques and photomeric techniques.RESULTS：Lwas 1 EU·mg-1Noninterference concentration of breviscapine for injection for bacterial endotoxin test was 0.25 g·L-1.CONCLUSION：It is feasible for bacterial endotoxin test instead of pyrogen test.

Breviscapine for injection；Bacterial endotoxin；Gel clot techniques；Photometric techniques

R915；R927.12

A

1001-0408（2010）39-3726-03

2010-03-03

2010-05-24）