靈芝顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

薛強(qiáng)，李卿，秦劍，肖銘玉（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，重慶市 400010；.重慶市中藥研究院，重慶市 400065）

靈芝顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

薛強(qiáng)1＊，李卿2，秦劍2，肖銘玉2（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，重慶市 400010；2.重慶市中藥研究院，重慶市 400065）

目的：建立靈芝顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜（TLC）法對方中靈芝、柴胡進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜法測定五味子中五味子甲素、五味子乙素含量。結(jié)果：TLC斑點(diǎn)清晰，分離度好，陰性對照無干擾；五味子甲素進(jìn)樣量、五味子乙素進(jìn)樣量分別在0.060～0.60、0.082～0.82μg范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好線性關(guān)系（r分別為0.999 6、0.999 5）；平均回收率分別為99.02%、99.06%，RSD分別為0.45%（n＝6）、0.48%（n＝6）。結(jié)論：定性定量方法快速、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，所建標(biāo)準(zhǔn)可用于靈芝顆粒的質(zhì)量控制。

靈芝顆粒；薄層色譜法；高效液相色譜法；靈芝；柴胡

靈芝顆粒是由靈芝、五味子、柴胡、郁金等4味藥材制成的純中藥制劑，具有保護(hù)肝臟、降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶和退黃作用，用于治療急性傳染性黃疸肝炎、遷延性肝炎、慢性肝炎、單項谷丙轉(zhuǎn)氨酶高等癥。為有效監(jiān)測制劑質(zhì)量，筆者對該產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究，用薄層色譜（TLC）法對制劑中的靈芝、柴胡進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜（HPLC）法測定五味子中有效成分五味子甲素、五味子乙素的含量。

1 儀器與材料

LC-2010型HPLC儀（日本島津公司）；二極管陣列紫外檢測器（上海顧村電光儀器廠）；AE-240S型電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；薄層色譜成像儀（瑞士卡瑪公司）。

五味子甲素、五味子乙素、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d對照品，靈芝、柴胡對照藥材（中國藥品生物制品檢定所，批號分別為110764-200107、110765-220205、110857-200405、110778-200404、120968-200203、0992-200102）；靈芝顆粒（重慶市中藥研究院自制，批號：091001、091101、091102）；各陰性樣品均由重慶市中藥研究院中藥化學(xué)室提供；乙腈為色譜純，水為去離子水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 靈芝的TLC鑒別

取本品2 g，研細(xì)，加乙醇30 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇3 mL使溶解，作為供試品溶液；另取靈芝對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液；另取缺靈芝陰性樣品2 g，同法制成缺靈芝陰性對照溶液。照TLC法[1]試驗，吸取上述3種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置于紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；陰性對照無干擾。靈芝的TLC見圖1。

2.2 柴胡的TLC鑒別

取本品3 g，研細(xì)，加甲醇30 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液；另取柴胡對照藥材0.5 g，加甲醇20 mL，同法制成對照藥材溶液；再取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d對照品，加甲醇制成每1 mL各含0.3 mg的溶液，作為對照品溶液；另取缺柴胡陰性樣品3 g，同法制成缺柴胡陰性對照溶液。照TLC法[1]試驗，吸取上述溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-乙醇-水（8∶2∶1，飽和10 min）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%對二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對照無干擾。柴胡的TLC見圖2。

圖1 靈芝的TLC1.供試品；2.靈芝對照藥材；3.缺靈芝陰性對照Fig 1 TLC of Ganoderma1.test sample；2.Ganodermareferencesubstance；3.negative control without Ganoderma

2.3 含量測定

2.3.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗色譜柱：Symmetry ODS C18（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）（梯度洗脫 ：0～8 min，A 的 體 積 分?jǐn)?shù) 為55%；8～22 min，A的體積分?jǐn)?shù)為55%～64%）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25℃；檢測波長：254 nm。理論板數(shù)按五味子甲素色譜峰計算應(yīng)不低于3 000，五味子甲素、五味子乙素與相鄰峰的分離度＞1.5。色譜見圖3。

2.3.2 供試品溶液的制備 取裝量差異項下的本品，研細(xì)，取約2.0 g，精密稱定，置于索氏提取器中，加三氯甲烷60 mL，回流提取4 h，回收三氯甲烷至適量，加硅膠1.5 g，攪拌均勻，干燥，置于硅膠柱（100～200目，1.5 g，內(nèi)徑1 cm）上，用三氯甲烷40 mL洗脫，收集三氯甲烷液，蒸干，殘渣用甲醇適量使溶解，加甲醇定容至25 mL，搖勻，過濾，即得。

圖2 柴胡的TLC1.供試品；2.柴胡對照藥材；3.缺柴胡陰性對照；4.柴胡皂苷a對照品；5.柴胡皂苷d對照品Fig 2 TLC of Bupleuri Radix1.testsample；2.Bupleuri Radix reference substance；3.negative control without Bupleuri Radix；4.saikosaponin a；5.saikosaponin d

圖3 高效液相色譜圖A.混合對照品；B.供試品；C.缺五味子陰性對照；1.五味子甲素；2.五味子乙素Fig 3 HPLC chromatogramsA.mixed control substance；B.test sample；C.negative control without Schisandrae Chinensis；1.deoxyschizandrin；2.γ-Schisandrin

2.3.3 混合對照品溶液的制備 精密稱取五味子甲素、五味子乙素對照品適量，加甲醇制成每1 mL含五味子甲素30μg、五味子乙素41μg的混合溶液，即得。

2.3.4 缺五味子陰性對照溶液的制備 取按處方比例及制備工藝制備的不含五味子的陰性樣品，按“2.3.2”項下方法制得缺五味子陰性對照溶液。

2.3.5 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品溶液2、5、10、15、20μL，按“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定。以峰面積積分值（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（C，μg）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得五味子甲素、五味子乙素的回歸方程分別為A＝1 124 602C－4 955.33（r＝0.999 6）、A＝1 351 247C－5 524.26（r＝0.999 5）。結(jié)果表明，五味子甲素、五味子乙素進(jìn)樣量分別在0.060～0.60、0.082～0.82μg范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.3.6 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10μL，按“2.3.1”項下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。結(jié)果，五味子甲素、五味子乙素的RSD分別為0.66%（n＝6）、0.85%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗 精密稱取樣品1份，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.3.1”項下色譜條件分別于0、4、6、10、14 h進(jìn)樣測定。結(jié)果，五味子甲素、五味子乙素的RSD分別為0.94%（n＝5）、1.20%（n＝5），表明供試品溶液在14 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 重復(fù)性試驗 精密稱取同批樣品6份，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.3.1”項下色譜條件測定。結(jié)果，五味子甲素、五味子乙素的RSD分別為1.10%（n＝6）、0.94%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的同批樣品6份，分別精密加入五味子甲素、五味子乙素，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.3.1”項下色譜條件測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 1Results of recovery test（n＝6）

2.3.10 樣品含量測定 取各批次靈芝顆粒，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.3.1”項下色譜條件測定。結(jié)果，3批（批號：091001、091101、091102）靈芝顆粒中每袋分別含五味子甲素1.26、1.64、1.54 mg，含五味子乙素1.95、2.21、2.14 mg。

3 討論

對本制劑中靈芝、柴胡進(jìn)行TLC鑒別研究，均以陰性樣品為對照。結(jié)果表明，各TLC斑點(diǎn)不受樣品中其它成分的干擾，專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可作為本制劑質(zhì)量控制檢測指標(biāo)。

本制劑由多味藥材提取制成，故對供試品溶液的提取方法（甲醇超聲提取法、甲醇回流提取法、三氯甲烷超聲提取法、三氯甲烷回流提取法）進(jìn)行比較。結(jié)果，甲醇提取法干擾較大，三氯甲烷超聲提取法含量偏低，而三氯甲烷回流提取法操作簡便，含量測定結(jié)果比較滿意；由于成分復(fù)雜，采用硅膠柱除雜，效果明顯，雜質(zhì)量大大減少，提高了色譜柱分離效果。

文獻(xiàn)報道[2～5]，五味子成分的分析多采用乙腈-水體系，但分離時間長，效果不理想；筆者經(jīng)反復(fù)考察，采用乙腈-磷酸水溶液梯度洗脫，效果明顯。在此條件下，樣品分離很好，可用于靈芝顆粒的質(zhì)量控制。

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：229、附錄31.

[2]竇志華，丁安偉，施 忠.反相高效液相色譜法測定復(fù)方五仁醇膠囊中2組分的含量[J].中國藥房，2007，18（3）：198.

[3]宣東平，竇志華，尤蝠儀.高效液相色譜法測定五味子浸膏中五味子醇甲與五味子乙素的含量[J].時珍國醫(yī)國藥，2008，19（3）：555.

[4]張立升，富玉海，呂文軍.HPLC法測定保肝膠囊中五味子乙素的含量[J].中國藥事，2007，21（6）：424.

Study on Quality Standard of Lingzhi Granules

XUE Qiang（The Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400010，China）
LI Qing，QIN Jian，XIAO Ming-yu（Chongqing Academy of Chinese Materia Medica，Chongqing 400065，China）

OBJECTIVE：To establish the quality standard of Lingzhi granules.METHODS：The qualitative identification of Ganoderma and Bupleuri Radix was carried out by TLC.The content of deoxyschizandrin and γ-Schisandrin inSchisandra chinensiswas determined by HPLC.RESULTS：The TLC sports were fairy clear and separated well without interference of negative sample.The linear ranges were 0.060～0.60 μg for deoxyschizandrin（r＝0.999 6），0.082～0.82 μg for γ-Schisandrin（r＝0.999 5），respectively.The average recoveries were 99.02%（RSD＝0.45%，n＝6）and 99.06%（RSD＝0.48%，n＝6）.CONCLUSION：The method is rapid，accurate and specific.It can be used for the quality control of Lingzhi granules.

Lingzhi granules；TLC；HPLC；Ganoderma；Bupleuri Radix

R283.627；R927.1

A

1001-0408（2010）39-3722-03

＊主治醫(yī)師，博士。研究方向：肝膽胰脾疾病。E-mail：kevin-999999@21cn.com

2010-03-07

2010-08-27）