不同血瘀造模對B16荷瘤鼠肝轉(zhuǎn)移模型的影響

潘永明，楊玉偉，劉瑞敏，陳亮，朱科燕，屠玨，何歡，陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究中心，杭州 310053)

研究報告

不同血瘀造模對B16荷瘤鼠肝轉(zhuǎn)移模型的影響

潘永明，楊玉偉，劉瑞敏，陳亮，朱科燕，屠玨，何歡，陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究中心，杭州 310053)

目的比較不同血瘀造模對B16荷瘤鼠肝轉(zhuǎn)移模型的影響。方法取60只6周齡雌性C57BL/6J小鼠，隨機分為正常對照組、單純荷瘤組、BS1(利血平法)組、BS2(游泳復(fù)合高分子右旋糖酐法)組、BS3(寒凝復(fù)合腎上腺素法)組和BS4(地塞米松復(fù)合腎上腺素法)組，首先根據(jù)中醫(yī)理論用不同造模方法形成血瘀模型，然后經(jīng)脾接種B16黑色素瘤建立肝轉(zhuǎn)移模型。用激光多普勒觀察小鼠耳廓微循環(huán)變化，并在接種后第15天小鼠眼眶取血，檢測紅細(xì)胞免疫功能和血清唾液酸酶(SA)含量的變化，并麻醉處死動物，觀察肝轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果①單純荷瘤組和各血瘀荷瘤組小鼠的耳廓微循環(huán)血流均明顯減少(P＜0.01)，以BS2組降低顯著。②單純荷瘤組和各血瘀荷瘤組小鼠的紅細(xì)胞免疫功能亦明顯降低(P＜0.01)，血清SA含量顯著升高(P＜0.05，P＜0.01)，以BS2和BS3組變化明顯。③肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率:單純荷瘤組、BS2組和BS3組均為100%，BS1組為80%，BS4組為60%，肝轉(zhuǎn)移抑制率: BS2組、BS3組、BS1組和BS4組分別為－71.76%、3.90%、16.42%、100.6%。④荷瘤鼠肝轉(zhuǎn)移的肝重與其耳廓微循環(huán)血流、紅細(xì)胞免疫功能和唾液酸酶含量具有顯著的相關(guān)性(P＜0.05，P＜0.01)。結(jié)論不同血瘀造模對B16荷瘤鼠肝轉(zhuǎn)移模型肝轉(zhuǎn)移發(fā)生程度具有明顯的影響，應(yīng)注意血瘀模型的選擇，且其與紅細(xì)胞免疫功能低下有關(guān)。

血瘀;B16黑色素瘤;肝轉(zhuǎn)移;紅細(xì)胞免疫功能;小鼠

侵襲與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最顯著的特征之一，由于其轉(zhuǎn)移過程的復(fù)雜和難以控制，已嚴(yán)重影響人類的生活質(zhì)量。近年來，大量文獻表明腫瘤患者血流學(xué)變化特征是血液呈高黏滯狀態(tài)，出現(xiàn)“濃、黏、凝、聚”改變，證實腫瘤與血瘀密切相關(guān)［1，2］，故目前活血化瘀中藥抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用研究大多建立在脾虛血瘀證或正常動物為基礎(chǔ)復(fù)制腫瘤轉(zhuǎn)移模型［3－5］，但往往研究結(jié)果與臨床療效差異較大，導(dǎo)致活血化瘀中藥抗惡性腫瘤的作用備受爭論［3］。而現(xiàn)代化中醫(yī)藥研究迫切需要具有中醫(yī)證候特點的病證結(jié)合動物模型，使中醫(yī)藥科研工作更加科學(xué)化，客觀化，同時滿足中西醫(yī)學(xué)的研究需要，是中西醫(yī)結(jié)合研究的基礎(chǔ)與難點［6］。由于血瘀證動物模型方法眾多，其不同造模方法對中藥抗腫瘤轉(zhuǎn)移評價結(jié)果是否存在影響均未有報道。為此，本文利用不同造模方法復(fù)制四種血瘀模型，并在其基礎(chǔ)上建立病證結(jié)合的血瘀證腫瘤肝轉(zhuǎn)移模型，比較不同血瘀造模方法對B16荷瘤鼠肝轉(zhuǎn)移模型的影響，從而為活血化瘀中藥的篩選和作用機理的研究提供理想和可靠的動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與瘤株

選用6周齡雌性SPF級C57BL/6J小鼠60只，體質(zhì)量(18±2)g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司［SCXK(滬)2007－0005］，動物飼養(yǎng)及無菌手術(shù)均在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心SPF級動物實驗設(shè)施中進行［SYXK(浙)2008－0115］。B16黑色素瘤瘤株，購自杭州昊天生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器與試劑

DRT4/PRM2型激光多普勒，英國Moor Instruments;Nikon YS100型光學(xué)顯微鏡，日本尼康公司;E12140型電子天平，美國Ohaus公司;DU800紫外分光光度計，Beckman Coulter;利血平注射液，廣東邦民制藥廠有限公司;鹽酸腎上腺素注射液，福州海王福藥制藥有限公司;地塞米松磷酸鈉注射液，浙江仙琚制藥股份有限公司;Dextran T－500，BoYun Biotech;唾液酸(SA)試劑盒，批號:20090914，由南京建成生物工程研究所提供;酵母多糖凍干試劑，由上海長海醫(yī)院免疫室提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組:適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機分為6組:①正常對照組;②單純荷瘤組:非血瘀(NBS)組;③BS1組:血瘀1組(利血平法);④BS2組:血瘀2組(游泳復(fù)合高分子右旋糖酐法);⑤BS3組:血瘀3組(寒凝復(fù)合腎上腺素法);⑥BS4組:血瘀4組(地塞米松復(fù)合腎上腺素法)，每組10只。

1.3.2 瘤細(xì)胞培養(yǎng)及接種:取對數(shù)生長期小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)液，PBS液洗2遍，然后0.25%胰酶消化1 min后，再PBS液清洗2遍，加PBS液吹打，1000 r/min 4℃離心10 min，收集細(xì)胞，重懸于PBS液中。細(xì)胞計數(shù)后，調(diào)細(xì)胞懸液濃度為3×106/mL，將細(xì)胞懸液置于冰上，用于小鼠脾臟接種。

1.3.3 血瘀證模型制備:①正常對照組:不做任何處理;②單純荷瘤組:每天股四頭肌注射生理鹽水每只鼠0.2 m L，連續(xù)17 d;③BS1組:參照文獻［3］，每天股四頭肌注射利血平注射液0.1 mg/(kg·bw)，連續(xù)17 d，造成血瘀;④BS2組:參照文獻［8，9］并加以改進，將小鼠放入水溫(43±0.5)℃，水深25 cm的水槽中游泳，當(dāng)全組50%鼠出現(xiàn)自然沉降時，全組停止游泳，連續(xù)17 d，并在游泳后第17天，小鼠尾靜脈快速注入10%高分子右旋糖酐生理鹽水液1.0 g/(kg·bw)，造成血瘀;⑤BS3組:參照文獻［10］，每日每只小鼠肌注生理鹽水0.2 mL，連續(xù)16 d，于第17天每只皮下注射腎上腺素0.02 mL，共2次，兩次間隔4 h。在第1次注射后2 h，將小鼠浸入冰水5 min，造成血瘀;⑥BS4組:參考文獻［11］并加以修改，小鼠每天肌注地塞米松磷酸鈉0.5 mg/(kg·bw)，連續(xù)16 d;第17天于每只皮下注射腎上腺素0.04 mL。除正常對照組外，小鼠均于第18天制作肝轉(zhuǎn)移模型。

1.3.4 肝轉(zhuǎn)移模型建立:用水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，取仰臥位固定，左上腹剪毛，常規(guī)消毒，在小鼠的左側(cè)肋弓下緣垂直切開，暴露脾臟，在脾臟的上極注入0.1 m L B16黑色素瘤細(xì)胞懸液，用棉簽輕壓針孔，然后關(guān)閉腹腔，縫合創(chuàng)面。

1.3.5 觀察指標(biāo):①每天觀察各組小鼠的飲食、毛色、精神活動、糞便等一般情況;②分別在造模第17天和第31天，應(yīng)用激光多普勒測定小鼠耳部微循環(huán)變化;③紅細(xì)胞免疫功能測定:紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)率(E－C3bR)、紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)率(E－ICR)參照郭峰方法［12，13］;④接種腫瘤細(xì)胞14d后，所有小鼠眼眶取血，分離血清，測定唾液酸酶(SA)含量;⑤動物麻醉處死后，肉眼觀察臟器的病理變化和計算小鼠肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率:肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率(%)=每組肝轉(zhuǎn)移的動物數(shù)/每組總的動物數(shù)×100%。同時取肝臟稱重，計算肝轉(zhuǎn)移抑制率:肝轉(zhuǎn)移抑制率(%)=(單純荷瘤組平均肝重–血瘀證荷瘤組肝重)/(單純荷瘤組平均肝重–正常對照組平均肝重)×100%。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況觀察

接種瘤株前，正常對照組和單純荷瘤組小鼠食欲正常，毛色光澤，行動活潑，體重增長良好，糞便正常。BS1組小鼠造模后體重下降明顯，并出現(xiàn)輕微畏寒、肢冷、食欲下降、稀便、聚堆、活動減少等表現(xiàn); BS2組小鼠隨造模時間的延長，游泳時間明顯縮短，被毛不光澤，大便略稀，精神萎頓，活動減少等表現(xiàn); BS3組小鼠造模后出現(xiàn)心跳加快、活動減少、肢體尾部蒼白、蜷縮等寒凝表現(xiàn);BS4組小鼠造模后體重明顯下降，活動減少，食欲降低，被毛不光澤等。期間，體重增長情況以正常對照組和單純荷瘤組＞BS3組＞BS2組＞BS4組和BS1組。

在接種瘤株時，因麻醉或手術(shù)原因造成BS2組和BS3組各有3只小鼠死亡，單純荷瘤組1只死亡;接種后1～3d小鼠體重均有下降，活動減少;3 d后各組小鼠體重均有不同程度的恢復(fù)，活動增加;接種10 d后，正常對照組和BS4組小鼠活動、食欲較好，而其余各組小鼠均出現(xiàn)飲食減少，腹部明顯膨隆，精神萎靡，體重較術(shù)前明顯上升;至接種后第14天處死前，正常對照組小鼠無死亡，單純荷瘤組自然死亡2只，BS2組和BS3組均自然死亡1只，BS1組因取血后死亡3只。

2.2 各組小鼠耳廓微循環(huán)的變化

結(jié)果顯示，血瘀造模后，四種造模方法的血瘀組小鼠耳廓微循環(huán)血流明顯低于正常對照組和單純荷瘤組(P＜0.01);接種瘤株14 d后，單純荷瘤組耳廓微循環(huán)血流亦明顯降低(P＜0.01)，而其他各血瘀組仍明顯低于正常對照組(P＜0.01)，與單純荷瘤組比，BS2組降低顯著(P＜0.05)，見表1。

表1 各組小鼠耳廓微循環(huán)血流的比較(±s，每100 g組織m L/min)Tab.1 Comparison of the blood flow in auricular microcirculation in different groups

表1 各組小鼠耳廓微循環(huán)血流的比較(±s，每100 g組織m L/min)Tab.1 Comparison of the blood flow in auricular microcirculation in different groups

注:與正常對照組比較，**P＜0.01;與單純荷瘤組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。Note:**P＜0.01 vs.normal control group;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs.NBS group.

組別(Group)動物數(shù)(n)17thd n 31thd正常對照組(Normal control)10 43.71±6.62 10 41.64±4.76單純荷瘤組(NBS)10 41.24±11.27 7 29.34±5.36**BS1組(BS1)10 23.46±5.61**△△7 33.17±4.84**BS2組(BS2)10 27.73±5.42**△△6 21.98±5.81**△BS3組(BS3)10 28.17±5.88**△△6 25.30±6.14**BS4組(BS4)10 24.81±5.91**△△10 29.21±7.61**

2.3 對紅細(xì)胞免疫功能的影響

結(jié)果顯示，腫瘤肝轉(zhuǎn)移發(fā)生后，單純荷瘤組和各血瘀組小鼠的紅細(xì)胞免疫功能均發(fā)生明顯紊亂，出現(xiàn)E－C3bR低下，E－ICR升高(P＜0.01)。與單純荷瘤組比，BS2組和BS3組小鼠E－C3bR顯著低于單純荷瘤組(P＜0.01)，且BS1組、BS2組和BS3組EICR均顯著高于單純荷瘤組(P＜0.05，P＜0.01)，但BS4組均略高于單純荷瘤組(P＞0.05)，見表2。

2.4 對血清唾液酸酶(SA)含量的影響

與正常對照組比，單純荷瘤組和各血瘀證荷瘤組小鼠SA含量均出現(xiàn)顯著升高(P＜0.05，P＜0.01);與單純荷瘤組比，除BS4組小鼠SA顯著低于單純荷瘤組(P＜0.05)外，其余各血瘀荷瘤組小鼠SA均略高于單純荷瘤組，但差異無顯著性(P＞0.05)，見圖1。

表2 各組小鼠紅細(xì)胞免疫功能的比較(±s，%)Tab.2 Comparison of erythrocyte immune function in different groups

表2 各組小鼠紅細(xì)胞免疫功能的比較(±s，%)Tab.2 Comparison of erythrocyte immune function in different groups

注:與正常對照組比較，**P＜0.01;與單純荷瘤組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。Note:**P＜0.01，vs.normal control group;△P＜0.05，△△P＜0.01，vs NBS group.

組別Group動物數(shù)(n) C3b受體花環(huán)率(E－C3bR)免疫復(fù)合物花環(huán)率E－ICR正常對照組(Normal control)10 17.94±2.64 6.24±0.65單純荷瘤組(NBS)7 11.33±1.99**9.52±1.21**BS1組(BS1)7 9.19±1.84**11.71±2.07**△BS2組(BS2)6 6.47±0.85**△△13.17±1.13**△△BS3組(BS3)6 7.57±2.01**△△13.74±1.33**△△BS4組(BS4)10 12.08±3.08**8.43±2.50**

注:與正常對照組比較，**P＜0.01;與單純荷瘤組比較圖1各組小鼠血清SA含量的比較Note:△P＜0.05。Note:**P＜0.01 vs.normal control group;△P＜0.05 vs NBS group.Fig.1 Comparison of serum SA contents in different groups

2.5 對腫瘤轉(zhuǎn)移的影響

接種瘤株14d后麻醉處死小鼠，經(jīng)剖檢發(fā)現(xiàn)正常對照組小鼠肝臟色澤鮮紅、有光澤，表面光滑，質(zhì)地柔軟，體積均一;而其他組小鼠均發(fā)生了不同程度的腫瘤肝轉(zhuǎn)移。其中單純荷瘤組、BS2組和BS3組肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率均為100%，BS1組為80%，且肝臟呈暗灰色，質(zhì)較硬，肝被膜表面及切面可見芝麻粒樣大小不等的黑色轉(zhuǎn)移灶，呈分散或成堆浸潤生長，脾臟亦有一定大小的瘤塊形成，其他臟器未見轉(zhuǎn)移灶。BS4組肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率為60%，且該組小鼠肝臟表面的轉(zhuǎn)移灶較其他荷瘤鼠明顯減少，脾臟瘤塊亦縮小顯著，肝臟色澤較其他荷瘤組好。另外，發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的小鼠剖腹后可見腹腔內(nèi)均有不等量的血性腹水，尤其是自然死亡時，小鼠體內(nèi)可見腹腔內(nèi)較多血性腹水，氣味腥臭。肝臟呈暗灰色，各葉表面及切面均有黑色的轉(zhuǎn)移灶，呈多發(fā)性彌散分布，其大小不一，而未發(fā)生轉(zhuǎn)移的小鼠肝臟表面光滑、質(zhì)地柔軟，見表3。

與正常對照組比，除BS4組外，其他荷瘤組小鼠肝重增加顯著(P＜0.01)，而BS4組肝重顯著低于單純荷瘤組(P＜0.01)，與正常對照組相當(dāng);從肝轉(zhuǎn)移抑制率來看，BS2組能促進肝轉(zhuǎn)移，而BS1組、BS3組和BS4組肝轉(zhuǎn)移抑制率分別為16.42%、3.90%和100.6%，以BS4組差異有顯著性(P＜0.01)，見表3。

2.6 荷瘤鼠肝轉(zhuǎn)移的肝重與耳廓微循環(huán)血流、紅細(xì)胞免疫功能、唾液酸酶的相關(guān)性

相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，荷瘤鼠肝轉(zhuǎn)移的肝重與耳廓微循環(huán)血流(r=－0.440)、紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)率(E－C3bR，r=－0.472)呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.01);而與紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)率(E－ICR，r=0.502，P＜0.01)和血清唾液酸酶(SA，r=0.343，P＜0.05)呈顯著正相關(guān)。

表3 各組小鼠肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率、抑制率及肝重比較(±s)Tab.3 Comparison of hepatic metastasis incidence rate，inhibition ratie and liver weight in different groups

表3 各組小鼠肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率、抑制率及肝重比較(±s)Tab.3 Comparison of hepatic metastasis incidence rate，inhibition ratie and liver weight in different groups

注:與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01;與單純荷瘤組比較，△△P＜0.01。Note:*P＜0.05，**P＜0.01 vs.normal control group;△△P＜0.01 vs NBS group.

組別Group動物數(shù)(n)轉(zhuǎn)移數(shù)(n) Metastasis number發(fā)生率(%) Incidence rate(%)肝重(g) Liver weight(g)抑制率(%) Inhibition rate(%)正常對照組(Normal control)10 0 0 0.89±0.05－單純荷瘤組(NBS)7 7 100 1.38±0.27**－BS1組(BS1)10 8 80 1.30±0.31**16.42 BS2組(BS2)6 6 100 1.72±0.76*－71.76 BS3組(BS3)6 6 100 1.36±0.40*3.90 BS4組(BS4)10 6 60 0.89±0.14△△100.6△△

3 討論

中醫(yī)學(xué)歷來從整體觀出發(fā)，認(rèn)為惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，主要是由于正氣虛損、陰陽失衡、臟腑功能失調(diào)，留滯客邪(致病因子)，致使氣滯血瘀、痰凝毒聚、相互膠結(jié)、蘊郁成腫瘤［14］?？梢?，瘀滯是腫瘤轉(zhuǎn)移最主要的病理基礎(chǔ)，而肝臟是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的常見靶器官之一，故本文以建立血瘀模型為基礎(chǔ)，并利用小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞脾臟接種，復(fù)制腫瘤肝轉(zhuǎn)移模型，模擬了腫瘤自發(fā)血行轉(zhuǎn)移的過程，其與臨床腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程有一定的相似性。研究發(fā)現(xiàn)，四種造模方法形成的血瘀模型小鼠耳廓微循環(huán)均出現(xiàn)明顯的障礙，相關(guān)分析顯示耳廓微循環(huán)血流與肝重呈顯著的負(fù)相關(guān)，且發(fā)現(xiàn)游泳復(fù)合高分子右旋糖酐法和寒凝復(fù)合腎上腺素法形成的血瘀模型均能加重荷瘤鼠的血瘀程度，提示氣血瘀滯可能是腫瘤的發(fā)生發(fā)展中非常重要的一個環(huán)節(jié)。

眾所周知，機體的免疫功能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展亦有著密切聯(lián)系。機體免疫系統(tǒng)能清除癌細(xì)胞，從而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，這一事實已得到公認(rèn)［15］?，F(xiàn)代研究認(rèn)為紅細(xì)胞免疫在抗腫瘤免疫機理中亦占有重要地位，已證實紅細(xì)胞有識別、粘附、濃縮和殺滅抗原的功能，并有清除循環(huán)免疫復(fù)合物的能力，還參與機體免疫調(diào)控［16，17］。紅細(xì)胞膜上的CR1是紅細(xì)胞發(fā)揮免疫功能的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，唾液酸是C3b受體的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，其能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移［18，19］。研究發(fā)現(xiàn)，四種血瘀模型均能引起荷瘤鼠紅細(xì)胞免疫功能發(fā)生明顯降低和血清SA含量升高，且其與肝轉(zhuǎn)移肝重密切相關(guān)，表明紅細(xì)胞免疫功能低下可能是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞進一步生長和擴散的重要原因之一，與楊運高等［15］研究結(jié)果相一致;另外，結(jié)果顯示四種血瘀造模方法對紅細(xì)胞免疫的變化依次以游泳復(fù)合高分子右旋糖酐法、寒凝復(fù)合腎上腺素法和利血平法三種方法較好。

研究結(jié)果顯示四種血瘀造模方法對荷瘤鼠肝轉(zhuǎn)移程度具有明顯的不同，其中利血平法、寒凝復(fù)合腎上腺素法和地塞米松復(fù)合腎上腺素法形成的血瘀狀態(tài)能減少腫瘤肝轉(zhuǎn)移，其部分結(jié)果與金莉等［4］報道脾虛血瘀證較為一致，而地塞米松復(fù)合腎上腺素法形成的血瘀證腫瘤肝轉(zhuǎn)移小鼠具有較高的抑制率，其可能與造模中使用了地塞米松有關(guān)，據(jù)報道，地塞米松不僅能誘導(dǎo)體外腫瘤細(xì)胞凋亡，還能在體內(nèi)誘導(dǎo)裸鼠宮頸癌移植瘤凋亡發(fā)生，顯著抑制腫瘤生長，并存在一定程度的劑量依賴效應(yīng)［20］。而游泳復(fù)合高分子右旋糖酐法形成的血瘀狀態(tài)能明顯促進腫瘤肝轉(zhuǎn)移，可能與其在這四種造模方法中其血瘀和紅細(xì)胞免疫低下程度最嚴(yán)重有關(guān)?？梢?，以游泳復(fù)合高分子右旋糖酐法形成的血瘀證荷瘤鼠肝轉(zhuǎn)移模型較好，也提示活血化瘀中藥抗腫瘤肝轉(zhuǎn)移篩選中，應(yīng)根據(jù)藥物的特點，選擇理想的血瘀造模方法，確保藥物療效和評價的準(zhǔn)確性。

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Effect of Differen.Methodsof M aking M odels of Blood Stasis Syndrom e on Hepatic M etastasis in Tum or-Bearing M ouse M odels

PAN Yong－ming，YANG Yu－wei，LIU Rui－min，CHEN Liang，ZHU Ke－yan，TU Jue，HE Huan，CHEN Min－li
(Zhejiang Chinese Medical University Laboratory Animal Research Center，Hangzhou 310053，China)

ObjectiveThe aim of this study was to compare the effect of different methods of making models of blood stasis syndrome on hepatic metastasis of tumors.M ethods 60 C57BL/6J mice(female，6 weeks old)were divided into six groups equally:normal control group，non stasis group，BS1(induced by reserpine)group，BS2(induced by swimm ing and high polymer dextran)group，BS3(induced by cold coagulation and adrenalin)group，and BS4(induced by dexamethasone and adrenalin)group.Models of blood stasis syndrome were generated by different methods in the mice and then hepatic metastases were induced in C57BL/6J mice by intrasplenic injection of B16 melanoma cells.The auricular microcirculation was measured by laser Doppler flowmetry.Blood was collected and the changes of serum SA level and erythrocyte immune function were detected at 14 days after tumor cell inoculation.Changes of hepatic metastasis were also observed.Results(1)The blood flow in auricular m icrocirculation was significantly decreased in the simple tumorbearing group and other blood stasis groups(P＜0.01)，especially in the BS2group.(2)The erythrocyte immune function of mice were significantly lowered in the simple tumor－bearing group and other blood stasis groups(P＜0.01)，while serum SA contents were remarkably raised(P＜0.05，P＜0.01)，especially in the BS2and BS3groups.(3)The hepatic metastasis incidence rate was 100%in simple tumor－bearing group，BS2and BS3groups，80%in the BS1group and 60% in the BS4group.The hepatic metastasis inhibition rates of the BS2，BS3，BS1and BS4groups were－71.76%，3.90%，16.42%and 100.6%，respectively.(4)There was a significant correlation between the weight of liver with tumor metastasis and the auricular microcirculation，red cell immune function，and SA level(P＜0.05，P＜0.01).ConlusionThere is an apparent effect of different methods of making models of blood stasis syndrome on the hepatic metastasis in B16melanoma－bearing mice.The change of erythrocyte immune function seems to be also related to this effect.It is also correlated with the decrease of erythrocyte immune function.Therefore，attention should be paid to select appropriate model of blood stasis syndrome in particular studies.

Blood stasis syndrome;B16 melanoma cells;Hepatic metastasis;Erythrocyte immune function;Mice

R－332

A

1005－4847(2010)04－0326－05

2009－12－28

浙江省教育廳科研基金項目(20071093);浙江省衛(wèi)生高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程項目。

潘永明(1979－)，男，助理研究員，從事實驗動物和動物實驗教學(xué)科研工作。E－mail:pym918@126.com

陳民利(1963－)，女，教授，研究方向:實驗動物與比較醫(yī)學(xué)。Email:minlichen01@yahoo.com.cn