D－半乳糖致衰老模型大鼠體征和骨髓DNA含量的改變與中藥干預(yù)作用

肖 慧，陶 濤，陳民利，冷曉霞，潘永明，朱科燕，謝日青，艾秀峰，余 佳

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究中心，杭州 310053)

研究報告

D－半乳糖致衰老模型大鼠體征和骨髓DNA含量的改變與中藥干預(yù)作用

肖 慧，陶 濤，陳民利，冷曉霞，潘永明，朱科燕，謝日青，艾秀峰，余 佳

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究中心，杭州 310053)

目的觀察D－半乳糖致衰老模型大鼠的一般癥狀、皮膚狀況、飲食嗜好及骨髓細胞 DNA含量的變化，并探討中藥抗衰老的作用及其機制。方法大鼠每日一次皮下注射D－半乳糖，連續(xù)7周，建立衰老大鼠模型，觀察衰老大鼠的一般癥狀和體重變化，測定其皮膚含水量、糖水消耗量和骨髓細胞DNA含量，并用抗衰老片和首烏延壽片進行干預(yù)，觀察中藥對衰老模型大鼠的干預(yù)作用。結(jié)果大鼠皮下注射D－半乳糖后，逐漸出現(xiàn)體重增長緩慢、行動遲緩、精神不振、嗜睡、被毛卷曲枯黃、光澤欠佳、尾部出現(xiàn)色素斑點等衰老癥狀，并在造模第5周出現(xiàn)體重下降，造模7周后，衰老大鼠的皮膚含水量和糖水消耗量明顯減少(P＜0.05)，骨髓細胞的DNA含量亦明顯減少(P＜0.01);給予抗衰老片和首烏延壽片后，均可不同程度地延緩衰老癥狀，緩解體重的下降，顯著提高皮膚的含水量和糖水消耗量(P＜0.01)，同時，明顯提高骨髓細胞 DNA含量(P＜0.05)。結(jié)論D－半乳糖致衰老大鼠模型的衰老體征明顯，機體抗DNA損傷的能力下降，而抗衰老片和首烏延壽片等中藥可明顯改善衰老模型大鼠的衰老癥狀，其作用機制可能與提高機體修復(fù)DNA損傷的能力有關(guān)。

D－半乳糖;衰老大鼠;骨髓細胞DNA含量;中藥

目前，人口老齡化問題已成為我國面臨的嚴(yán)峻問題，衰老與抗衰老是當(dāng)今世界醫(yī)學(xué)研究的熱點，探求有效的抗衰老方法和藥物已成為當(dāng)今世界的重大醫(yī)學(xué)課題。我國中醫(yī)藥學(xué)經(jīng)過數(shù)千年的發(fā)展歷程，在延緩衰老方面形成了獨特的理論與體系，積累了豐富的經(jīng)驗，以其獨特的療效在抗衰老研究中占有日益重要的地位［1－3］。皮膚出現(xiàn)皺紋、色素斑，體重下降，反應(yīng)遲鈍，記憶力減退等都是衰老的標(biāo)志。本實驗用皮下注射D－半乳糖建立大鼠衰老模型，觀察衰老大鼠的一般癥狀、體重、皮膚的含水量、糖水消耗量等體征和骨髓細胞 DNA含量的改變，并對衰老模型大鼠進行抗衰老片和首烏延壽片等中藥干預(yù)，探討中藥的抗衰老作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及飼養(yǎng)環(huán)境

SPF級 Wistar大鼠，雌雄各半，體重:雌200～220 g，雄240～260 g，由中科院上海實驗動物中心/上海斯萊克實驗動物公司提供［SCXK(滬)2007～0005］，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心屏障系統(tǒng)內(nèi)［SYXK(浙)2003～0003］。

1.2 試驗藥物及配制

抗衰老片(浸膏粉)，批號:080320，臨用前用蒸餾水溶解至濃度 30 mg/mL;首烏延壽片，批號: A060801，臨用前用蒸餾水溶解至濃度52.5 mg/mL。

1.3 主要試劑與儀器

D－半乳糖，批號:20071115，上海恒信化學(xué)試劑有限公司(原上海試劑二廠);BIO－Rad酶標(biāo)儀(美國BIO－Rad公司);Allegra X－15R大容量離心機(美國Beckman公司);數(shù)顯不銹鋼鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅科技有限公司)。

1.4 造模與給藥

用皮下注射D－半乳糖建立大鼠衰老模型［4］，取Wistar大鼠48只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，觀察有無異常情況，然后將大鼠稱重，編號，按體重隨機分成4組，每組12只，雌雄各半，按3只/籠飼養(yǎng)，自由進食飲水。除空白對照組外，其余各組每天一次頸背部皮下注射 5%D－半乳糖生理鹽水溶液，劑量為 100 mg/kg，連續(xù)造模7周。自造模第1天開始經(jīng)口灌胃給藥，抗衰老片組給予0.30 g/kg劑量的抗衰老片，首烏延壽片組給予0.525 g/kg的首烏延壽片，模型對照組和空白對照組給予蒸餾水10 mL/kg，每日一次，連續(xù)給藥7周。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 一般癥狀和體重觀察:試驗期間，每日觀察大鼠的精神、姿勢、皮毛、眼裂大小、黏膜、耳廓和糞便等體征情況，并每日上午同時間在飼喂前稱重。

1.5.2 皮膚含水量測定:動物處死后，取部分背部皮膚，去除被毛，稱濕重，然后置于85℃烘箱中，連續(xù)48 h，烘干，再稱重，按照下述公式計算皮膚含水量。

1.5.3 糖水消耗實驗:測試前分別每籠放置兩瓶水，1瓶蒸餾水，1瓶1%的蔗糖水溶液，稱重，12 h后兩瓶水對調(diào)位置，連續(xù)放置24 h后稱重，計算糖水消耗情況。

1.5.4 骨髓DNA含量測定:取右側(cè)股骨，除去軟組織，使用注射器吸取5 mmol/L的CaCl2溶液將全部骨髓沖入離心管中，4℃冰箱中放置30 min，2500 r/ min離心15 min，棄上清，向沉淀物中加入0.2 mol/ L的HClO410 mL充分混勻，90℃加熱15 min，冷卻，3500 r/min離心10 min，取上清液200 μL加入96孔板中，在BIO－Rad多功能酶標(biāo)儀上測A260值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

所有計量數(shù)據(jù)均表示為均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差，采用SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計分析，檢驗方法采用 One－Way ANOVA分析和Dunnett－t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 D-半乳糖致衰老大鼠一般癥狀和體重的變化及中藥的干預(yù)作用

大鼠皮下注射 D－半乳糖后，逐漸出現(xiàn)衰老癥狀，在造模2周后，模型對照組大鼠體重增長緩慢，同時出現(xiàn)活動減少、行動遲緩、精神不振、嗜睡、反應(yīng)遲鈍、被毛卷曲、枯黃、易脫落、光澤欠佳等現(xiàn)象，造模第4周，出現(xiàn)尾部色素斑點沉著斑點，并隨著時間的推移而加重(圖1)，在造模第5周，衰老模型大鼠的體重下降。給予抗衰老片和首烏延壽片后，與模型對照組比較，衰老大鼠的精神狀態(tài)明顯改善，行動相對靈活，毛發(fā)較潤澤，體重增加。圖1顯示，抗衰老片組和首烏延壽片組大鼠在造模期間均未出現(xiàn)明顯的體重下降現(xiàn)象。

圖1 D－半乳糖致衰老大鼠體重增長變化及中藥的干預(yù)作用Fig.1 Body weight changes of ageing rats induced by D－galactose and interventional effect of traditional Chinese medicine

2.2 D-半乳糖致衰老大鼠糖水消耗量和皮膚含水量的變化及中藥的干預(yù)作用

與正常對照組比較，模型對照組大鼠的糖水消耗量在造模5周后就出現(xiàn)明顯的下降(P＜0.01)。造模7周后，模型對照組大鼠皮膚含水量亦出現(xiàn)明顯降低(P＜0.05)，給予抗衰老片和首烏延壽片后，均可顯著提高衰老大鼠糖水消耗量和皮膚的含水量(P＜0.01)(表1)。

表1 D－半乳糖致衰老大鼠皮膚含水量和糖水消耗量變化及中藥的干預(yù)作用(n=12)Tab.1 Skin water content changes of ageing rats induced by D－galactose and interventional effect of traditional Chinese medicine(n=12)

2.3 D-半乳糖致衰老大鼠骨髓細胞DNA含量的變化和中藥的干預(yù)作用

與正常對照組比，模型對照組衰老大鼠骨髓細胞DNA含量明顯減少(P＜0.01);給予抗衰老片和首烏延壽片后，均可不同程度地提高衰老大鼠骨髓細胞DNA含量，與模型對照組比，有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)(圖2)。

圖2 D－半乳糖致衰老大鼠骨髓細胞DNA含量的變化及中藥的干預(yù)作用Fig.2 Bone marrow DNA content changes of ageing rats induced by D－galactose and interventional effect of traditional Chinese medicine

3 討論

機體衰老后，一般表現(xiàn)為皮膚彈性下降、毛色枯黃、脫毛、行動遲緩、嗜睡以及體重增長緩慢甚至下降等癥狀。本試驗結(jié)果，皮下注射 D－半乳糖后，大鼠出現(xiàn)體重增長緩慢甚至下降，并出現(xiàn)精神不振、嗜睡、被毛卷曲、枯黃、易脫落、光澤欠佳、尾部出現(xiàn)色素斑點等現(xiàn)象，提示模型大鼠出現(xiàn)了明顯的衰老癥狀;給予抗衰老片和首烏延壽片干預(yù)后，均不同程度地緩解衰老癥狀，表明中藥對D－半乳糖致衰老模型大鼠有一定的抗衰老作用。

皺紋是皮膚衰老的典型特征之一，而它的形成與皮膚的水合能力有關(guān)。老化皮膚由于水合能力降低、組織細胞的水分減少，出現(xiàn)細胞皺縮、老化、組織缺水、萎縮，導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)皺紋［5］。本試驗結(jié)果顯示，造模7周后，衰老大鼠的皮膚含水量明顯降低，表明大鼠皮膚開始出現(xiàn)老化，而給予抗衰老片和首烏延壽片干預(yù)后，衰老大鼠的皮膚含水量明顯增加，說明中藥的干預(yù)可防止皮膚老化，延緩衰老。

傳統(tǒng)中醫(yī)理論認為腎為先天之本，腎中精氣的充盛與否決定著機體衰老的發(fā)生，腎中精氣充足則機體的衰老就會相對延緩?，F(xiàn)代醫(yī)家大都認為腎虛是衰老的主要原因之一，并運用西醫(yī)學(xué)理論和實驗進行充分論證［6］。腎虛在情志方面表現(xiàn)為情緒不佳、抑郁、狂躁等。而糖水消耗量可作為測量快感缺乏的有效客觀依據(jù)［7］，本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著造模時間的延長，老年大鼠糖水消耗量明顯的下降，說明老年大鼠活力減退，精神不振，對周圍事物不感興趣。給予抗衰老片和首烏延壽片后，糖水消耗量可顯著升高，說明中藥可使老年大鼠活力升高，改善其精神狀態(tài)，延緩衰老。

衰老的 DNA損傷修復(fù)學(xué)說認為，細胞中的DNA在內(nèi)環(huán)境和外環(huán)境損傷因素的作用下，會受損而導(dǎo)致DNA鏈斷裂，使親代和子代間遺傳信息的傳遞發(fā)生錯誤。但細胞借助于一整套DNA修復(fù)系統(tǒng)，不斷地糾正復(fù)制錯誤，修補斷裂的DNA鏈，使遺傳信息能準(zhǔn)確地從親代傳至子代［8］。但是這種修復(fù)能力隨著分裂次數(shù)的增多而降低，從而導(dǎo)致?lián)p傷積累，引起基因變異和表達異常，最終使生物衰老［9］。細胞DNA含量的高低可反映其分裂增殖活性，DNA含量增多，細胞分裂增殖旺盛，反之則分裂增殖受抑制［10］。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，造模7周后，衰老模型大鼠骨髓DNA含量明顯降低，說明衰老大鼠機體修復(fù)DNA損傷的能力下降，而給予抗衰老片和首烏延壽片等中藥干預(yù)后，衰老大鼠骨髓DNA含量顯著提高，提示中藥干預(yù)抗衰老作用機制可能與提高機體修復(fù)DNA損傷的能力有關(guān)。

綜上所述，D－半乳糖致衰老大鼠出現(xiàn)體重下降，皮膚含水量明顯下降，糖水消耗量明顯下降，骨髓中DNA含量也明顯降低，這與人體衰老的表現(xiàn)一致［11，12］，故該模型是較理想的研究、篩選抗衰老藥物的動物模型。本研究用抗衰老片和首烏延壽片干預(yù)后，可明顯改善衰老模型大鼠的衰老癥狀，表明抗衰老片和首烏延壽片等中藥具有一定的抗衰老作用，其機制可能與提高機體修復(fù)DNA損傷的能力有關(guān)。

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Changes of General Physical Signs and Bone Marrow DNA Content of Ageing Model Rat Induced by D-galactose and Interventional Effect of Traditional Chinese Medicine

XIAO Hui，TAO Tao，CHEN Min－li，LENG Xiao－xia，PAN Yong－ming，ZHU Ke－yan，XIE Ri－qing，AI Xiu－feng，YU Jia
(Zhejiang Chinese Medical University Laboratory Animal Research Center，Hangzhou 310053，China)

ObjectiveTo observe the changes of general symptom，skin status，diet addiction and bone marrow DNA content of the ageing model rat induced by D－galactose，and to study the anti－ageing effect of traditional Chinese medicine and its mechanism。MethodsRats were injected with D－galactose subcutaneously once a day for seven weeks to establish ageing rat model.To observe the changes of the general symptom and body weight，and determine skin water content，sucrose consumption and bone marrow DNA content.The administration group rats were given anti－ageing tablets and ShouWu Yanshou tablets respectively to observe the interventional effect of the traditional Chinese medicine。ResultsAfter injected D－galactose，the body weight increased slowly，and the rat showed slow action，lassitude，sleepiness，curl and dry yellow hair coat，bad luster and color spots in the tail.After 5 weeks，the body weight decreased.After 7 weeks，skin water content and sucrose consumption decreased significantly(P＜0.05)，and bone marrow DNA content also decreased significantly(P＜0.01).After administration of anti－ageing tablets and ShouWu YanShou tablets，the ageingsymptom and the reduction of body weight of ageing rats improved to a certain extent.The skin water content and sucrose consumption increased significantly(P＜0.01)，and bone marrow DNA content increased significantly(P＜0.05)。Conclusions The ageing rat model induced by D－galactose appeared ageing physical signs obviously and anti－DNA damage capability of the body decreased.Traditional Chinese medicine could improve the ageing symptom of the ageing model rat，and its mechanism may be related to enhance the capability of repairing DNA damage of the body.

D－galactose;Ageing rat;Bone marrow DNA content;Traditional Chinese medicine

R332;R285.5

A

1671－7856(2010)05－0037－04

2009－12－24

浙江省中醫(yī)“治未病”研究專項(2007WB022);“浙江省衛(wèi)生高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程項目”資助。

肖慧，女，碩士生。

陳民利(1963－)，女，教授，碩導(dǎo)，研究方向;比較醫(yī)學(xué)。E－mail:minlichen01@yahoo.com.cn