豬體細(xì)胞核移植電融合參數(shù)的研究

聞福安，羅光斌，任建成

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽 110161）

豬體細(xì)胞核移植中，去核卵母細(xì)胞經(jīng)顯微操作注入顆粒細(xì)胞后，經(jīng)過電融合才能繼續(xù)發(fā)育。影響豬體細(xì)胞核移植的一個重要環(huán)節(jié)就是卵母細(xì)胞供體核的融合，提高融合效率可以提高重構(gòu)胚基因組編程和發(fā)育效率。電融合是核移植操作中廣為使用的一種無損傷性的細(xì)胞融合方法，電刺激不僅能使細(xì)胞間發(fā)生融合，而且還能激活卵母細(xì)胞，因此對核移植后重組胚的形成和激活起著非常關(guān)鍵的作用[1]。電融合操作中有多個參數(shù)，各個參數(shù)的變化以及不同參數(shù)的組合直接影響到重組胚的形成、激活以及后續(xù)發(fā)育的效率[2]。本研究主要對比了幾種不同電融合參數(shù)的核融合率以及不同融合參數(shù)對核移植卵母細(xì)胞卵裂率的影響，旨在尋找最佳融合參數(shù)組合，為提高豬體細(xì)胞核移植效率提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

PMSG、HCG購自寧波第二激素廠，其他試劑均購于Sigma公司。

1.2 卵巢的采集

本試驗(yàn)所用卵巢均采集于東生屠宰場，采集到的卵巢放入31～37℃含雙抗生理鹽水中，2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室[3]。

1.3 卵母細(xì)胞的采集與成熟培養(yǎng)

采用抽吸法采集卵母細(xì)胞。將運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室的卵巢用含有雙抗的生理鹽水沖洗幾遍，然后用帶有12號針頭的10 mL無菌注射器抽吸卵泡液。抽吸前先用注射器抽取少量PBS緩沖液，然后選取直徑 2～6 mm、卵泡液清亮的卵泡抽吸卵泡液[4]。將卵泡液移入試管中保溫沉淀，在體視顯微鏡（MOT IC SMZ-168）下挑選質(zhì)量好的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）。用體外成熟液清洗COCs 3次后進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)。所用的體外成熟培養(yǎng)液為NCSU-23+10 IU·mL-1PMSG+10 IU·mL-1HCG+10%FBS。

本試驗(yàn)采用微滴法培養(yǎng)卵母細(xì)胞，以礦物油覆蓋，每個微滴50 μL，放入10～15枚卵，39℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)44～48 h。

1.4 卵母細(xì)胞成熟率檢查

卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)后，用0.1%透明質(zhì)酸酶脫去顆粒細(xì)胞，在實(shí)體顯微鏡下觀察。以排出第一極體作為卵母細(xì)胞成熟標(biāo)準(zhǔn)。脫去的顆粒細(xì)胞用操作液（NCSU-23 含 FBS 10%，CB 7.5 μg·mL-1）清洗 3次后作為供體細(xì)胞待用。

1.5 去核

將成熟檢查后排出極體的卵母細(xì)胞移入操作液中，37℃平衡15 min，再移至覆蓋礦物油的操作液滴中顯微操作。去核方法采用二步擠壓法，先用固定針固定卵母細(xì)胞使第一極體位于12點(diǎn)方向。將玻璃針在第一極體兩側(cè)1/5～1/4卵周長處，沿第一極體（或卵周隙擴(kuò)大的部分）刺穿透明帶后，挑開透明帶或在固定管上摩擦幾下，在透明帶上會形成1/5～1/4卵周長的切口。將玻璃針換成鈍端去核管后，調(diào)整卵母細(xì)胞的透明帶切口方向，使其位于固定管的上方或下方，直接用鈍端去核管在透明帶切口的斜下方推擠卵母細(xì)胞，使第一極體連同其附近的1/4～1/3胞質(zhì)溢出透明帶，然后用鈍端去核管吸除溢出透明帶的第一極體及其附近的胞質(zhì)。

1.6 注核

挑選直徑為15～20 μm、折光性強(qiáng)、圓形、光滑的顆粒細(xì)胞（成熟培養(yǎng)卵母細(xì)胞用0.1%透明質(zhì)酸酶處理后脫離的顆粒細(xì)胞），從去核切口放入卵周隙，用注射針點(diǎn)壓透明帶，使供體細(xì)胞與受體卵的胞膜接觸緊密，每批操作30個卵母細(xì)胞，結(jié)束后將供體細(xì)胞-卵胞質(zhì)構(gòu)成的重構(gòu)卵轉(zhuǎn)移到NCSU-23+10%FBS中，在38.5℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中恢復(fù)1.5 h。

1.7 細(xì)胞融合及培養(yǎng)

本試驗(yàn)所采用的細(xì)胞融合儀為富士平公司ET-3型細(xì)胞融合儀，采用針式電極。將已注入卵丘的去核卵母細(xì)胞在融合液（0.3 mol·L-1甘露醇+0.1 mmol·L-1MgCl2+0.05 mmol·L-1CaCl2）中平衡 2 min，在顯微上用電極輕輕轉(zhuǎn)動重組胚，使供核細(xì)胞與去核卵母細(xì)胞的接觸面與電場方向垂直，然后設(shè)定不同的場強(qiáng)（0.4、0.8、1.2、1.6 kV·cm-1）和不同脈沖時程（20、30、40、50 μs）進(jìn)行融合。為簡化試驗(yàn)，本試驗(yàn)只研究1次脈沖刺激的最佳融合條件。

根據(jù)李日聰?shù)仍囼?yàn)，選擇20 μs脈沖時程作為初始條件[5]。融合后用NCSU 23+10%FBS胚胎培養(yǎng)液清洗3次，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約30 min，在顯微鏡下觀察，以卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞膜的連接是否消失來判斷卵丘細(xì)胞是否進(jìn)入卵母細(xì)胞中。將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入NCSU 23+10%FBS的胚胎培養(yǎng)液中進(jìn)行微滴培養(yǎng)，每50 μL 10～15枚，上蓋礦物油，在 38.5℃、飽和濕度的 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h進(jìn)行半量換液。44～48 h后觀察卵裂情況，記錄卵裂率。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，采用Ducan′s法進(jìn)行多重比較。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同電場強(qiáng)度對重構(gòu)胚融合率及卵裂率的影響

20 μs脈沖過程時，不同電場強(qiáng)度對重構(gòu)胚融合率及卵裂率的影響見表1。

由表1可知，當(dāng)場強(qiáng)為0.8 kV·cm-1時，融合率為 57.5%，顯著高于 0.4、1.2、1.6 kV·cm-1組（P＜0.05）。0.4 kV·cm-1組融合率與 1.2、1.6 kV·cm-1組相比差異顯著（P＜0.05）。1.2、1.6 kV·cm-1組間融合率差異不顯著（P＞0.05）。

表1 不同場強(qiáng)對重構(gòu)胚融合率及發(fā)育率的影響

融合后再培養(yǎng)44～48 h，發(fā)現(xiàn)0.8 kV·cm-1組卵裂率與 1.2 kV·cm-1組相比差異不顯著（P＞0.05），0.4 kV·cm-1組卵裂率與 1.6 kV·cm-1組差異不顯著（P＞0.05），其余各組差異顯著（P＞0.05）。

2.2 不同脈沖時程對重構(gòu)胚融合率及卵裂率的影響

0.8 kV·cm-1場強(qiáng)時，不同脈沖時程對重構(gòu)胚融合率及卵裂率的影響見表2。

表2 不同脈沖時程對重構(gòu)胚融合率及發(fā)育率的影響

由表2可知，脈沖時程為20 μs時融合率與30、40、50 μs組差異顯著（P＜0.05），其余各組融合率差異均不顯著。融合后培養(yǎng)44～48 h，觀察卵裂情況發(fā)現(xiàn)，20 μs組與 30 μs組差異不顯著（P＞0.05），40 與 50 μs組差異不顯著（P＞0.05），其余各組均差異顯著（P＜0.05）。

3 討論

電場強(qiáng)度和脈沖時程要保持一定比例，脈沖時程和次數(shù)一定時，場強(qiáng)增大可以使微孔直接和數(shù)目增加，但增大到一定限度時，則造成不可逆損傷，細(xì)胞裂解[6]。場強(qiáng)一定時，脈沖時程的增加同樣會使顆粒細(xì)胞（供體細(xì)胞）與卵母細(xì)胞（受體細(xì)胞）質(zhì)膜間接觸面的微孔數(shù)增多，有益于細(xì)胞融合，但超過一定限度同樣會造成不可逆損傷，造成細(xì)胞死亡，過度的電刺激還會使細(xì)胞染色體解離，出現(xiàn)染色體不正常構(gòu)建，影響核移植胚的發(fā)育。Ozil等研究結(jié)果顯示，電脈沖時間為35和100 μs時，胚胎融合和發(fā)育率無差異；超過100 μs時，融合率顯著降低，卵裂球裂解顯著增多，胚胎發(fā)育率降低[7]。這與本試驗(yàn) 30、40、50 μs組差異不顯著的結(jié)果相一致。

本試驗(yàn)表明，場強(qiáng)為0.8 kV·cm-1時細(xì)胞融合率最高，與 0.4、1.2、1.6 kV·cm-1組差異均顯著（P＜0.05）。0.4 kV·cm-1組由于場強(qiáng)過低，在 20 μs時程搭配下，細(xì)胞膜不能有效穿孔或穿孔面積數(shù)量不夠，不能誘導(dǎo)有效地融合。當(dāng)場強(qiáng)由0.80 kV·cm-1上升到1.6 kV·cm-1時，場強(qiáng)過強(qiáng)，形成較多不可以擊穿，融合率下降，胚胎發(fā)育能力受損，細(xì)胞率降低。本試驗(yàn)0.8 kV·cm-1組與1.2 kV·cm-1組細(xì)胞率差異不顯著（P＞0.05），可能是電刺激造成細(xì)胞發(fā)育不良的場強(qiáng)要比造成融合率下降的場強(qiáng)高。

本試驗(yàn)還表明，在場強(qiáng)固定為0.8 kV·cm-1情況下，20 μs的脈沖時程細(xì)胞融合率最佳，顯著高于其他 3組（P＜0.05）。說明 80 kV·cm-1場強(qiáng)、1次脈沖、20 μs脈沖時程的電融合參數(shù)對豬核移植胚有良好的融合效果。20 μs組與 30 μs組細(xì)胞率差異不顯著（P＞0.05），融合率差異顯著（P＜0.05）又一次說明了對核移植胚發(fā)育造成不良影響的電刺激比對融合造成不良影響的電刺激強(qiáng)度高。

4 結(jié)論

在本實(shí)驗(yàn)室條件下，豬體細(xì)胞核移植電融合最佳參數(shù)為 0.8 kV·cm-1、20 μs、1 次脈沖。

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