微小亞歷山大藻對黑鯛仔魚的抗氧化酶和ATPase的脅迫影響

蔣玫，黃世林，倫鳳霞，夏培艷

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2. 國家海洋局第二海洋研究所，浙江 杭州 310012；3. 上海市水文總站 上海 20023；4. 上海海洋大學(xué)，上海 200336)

微小亞歷山大藻對黑鯛仔魚的抗氧化酶和ATPase的脅迫影響

蔣玫1，黃世林2，倫鳳霞3，夏培艷4

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2. 國家海洋局第二海洋研究所，浙江 杭州 310012；3. 上海市水文總站 上海 20023；4. 上海海洋大學(xué)，上海 200336)

研究了暴露于微小亞歷山大藻藻液中的黑鯛仔魚其超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、過氧化物酶(CAT)和Na+-K+-ATPase酶活性在4 d時間內(nèi)的變化，結(jié)果表明，微小亞歷山大藻藻液對仔魚的GSH-PX和CAT活性誘導(dǎo)作用明顯，尤其對處于染毒時間2 d內(nèi)，這種作用較強(qiáng)，但隨著實(shí)驗(yàn)時間的延長又表現(xiàn)出抑制作用。微小亞歷山大藻藻液對SOD也有強(qiáng)烈的誘導(dǎo)作用，這種作用可持續(xù)3 d，但隨后則表現(xiàn)為抑制作用。仔魚的3種酶活性與染毒的藻液均符合較明顯的劑量－效應(yīng)關(guān)系，即實(shí)驗(yàn)藻液濃度越大，對酶活性的抑制率越低，對生物毒性越大。但藻液對于Na+-K+-ATPase酶卻表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用，顯示出濃度－效應(yīng)關(guān)系。其與上述3種酶的活力變化可以一起作為水體中藻液污染的生物指示器。

微小亞歷山大藻，仔魚，抗氧化酶，ATPase

藻毒素不僅能直接導(dǎo)致漁業(yè)生物的大量死亡[1],甚至還可通過影響魚類的幼體或生活史的其它階段改變海洋營養(yǎng)結(jié)構(gòu)[2]。微小亞歷山大藻能產(chǎn)生一種稱為麻痹性貝毒 (PSP) 的藻毒素。大量的研究表明，藻毒素具有極高的細(xì)胞選擇性，在生物機(jī)體內(nèi)所引發(fā)的許多細(xì)胞學(xué)變化，主要緣于生物體酶系統(tǒng)的破壞，從而引發(fā)一系列的中毒特征。例如低細(xì)胞密度藻對菲律賓蛤仔、翡翠貽貝的鰓組織的Na+-K+-ATPase酶活性的有激活作用，而高密度藻則能抑制蛋白磷酸酶的活性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化調(diào)節(jié)失衡，最終對生物的多種生理功能造成影響[3]。此外，麻痹性毒素還能通過賴膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)胞，引起乳酸脫氫酶 (LDH) 釋放率和細(xì)胞內(nèi)活性氧基 (ROS) 的升高，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化引起的氧化損傷的毒性現(xiàn)象，使得水生生物的肝臟表現(xiàn)出充血紅腫和血斑的中毒癥狀[4]。

不少學(xué)者認(rèn)為，魚類對外源物的生物轉(zhuǎn)化中，可生成危害性大的活性氧中間代謝物，并產(chǎn)生大量的活性氧自由基，這些活性氧會對機(jī)體造成氧化脅迫, 引起酶失活[5,6]。GSH-PX是魚體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過氧化物分解的酶類。SOD、CAT則是魚類體內(nèi)參與免疫防御的重的抗氧化酶。這些酶的活性水平與細(xì)胞免疫防御能力密切相關(guān)。而Na+-K+-ATPase酶作為生物體內(nèi)重要的代謝酶，在能量代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化磷酸化等生化過程中起著重要作用，常作為污染物評價的重要指標(biāo)[7]。

本研究以黑鯛仔魚為實(shí)驗(yàn)對象，通過檢測被微小亞歷山大藻藻液染毒后仔魚體內(nèi)SOD酶、GSH酶、Na+-K+-ATPase酶和CAT酶的活性變化，分析微小亞歷山大藻對仔魚抗氧化系統(tǒng)的影響，了解其抗氧化能力及免疫防御水平。以期為評價微小亞歷山大藻對早期魚類生物的生態(tài)毒理負(fù)面效應(yīng)提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)黑鯛來自江蘇省水產(chǎn)研究所養(yǎng)殖場的親魚直接產(chǎn)的魚卵經(jīng)孵化四天后的初孵仔魚。實(shí)驗(yàn)用水來源于養(yǎng)殖場經(jīng)過濾的自然海水，主要鹽度為22。

微小亞歷山大藻藻種(AM-1藻株)由臺灣大學(xué)周宏農(nóng)教授實(shí)驗(yàn)室提供，在實(shí)驗(yàn)室以2 L三角燒瓶f/2培養(yǎng)液單種培養(yǎng)，溫度20±1℃，光照3 000 lx，光暗比12 h∶12 h。選用指數(shù)生長期中期的藻液用于實(shí)驗(yàn)?？刂茖?shí)驗(yàn)溫度為20.2 ℃左右，溫度變幅不超過2.0 ℃，pH為7～8，并保持實(shí)驗(yàn)用水溶解氧為飽和溶氧的60% 以上。

1.2 方法

1.2.1 仔魚的藻液染毒實(shí)驗(yàn)

將藻細(xì)胞原液作為母液與過濾海水按一定比例混合稀釋成（約50 000 cell/mL、30 000 cell/mL、15 000 cell/mL、10 000 cell/mL）4個濃度組，同時以過濾海水為對照組，每一個濃度組設(shè)3個平行樣本，在每個3 000 mL的白搪瓷盆中投入已經(jīng)開口的仔魚(卵黃囊已經(jīng)消失，平均體長約為2.34 mm，體重為0.004 9 g，口唇張開度為0.3 mm)。每個平行樣投放仔魚約300尾左右，充氧氣，每天換水一次（20%），進(jìn)行投餌（輪蟲）一次，觀測4 d內(nèi)的生長情況，記錄仔魚生長游動情況、外觀畸形以及死亡數(shù)量。每24 h隨機(jī)抽取50尾左右保存于液氮容器中，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行抗氧化系統(tǒng)指標(biāo)的測定和分析。

1.2.2 抗氧化系統(tǒng)指標(biāo)測定

分別向仔魚整體加適量4 ℃冰冷雙蒸水,高速組織勻漿機(jī)( Polytron, PT2MR 2100) 勻漿, 離心10 min (2 ℃、3 300 r/min) , 取上清液用于酶活力測定。SOD、GSH-PX、CAT以及Na+-K+-ATPase活性測定均采用南京建成生物工程研究所的專用試劑盒進(jìn)行。SOD活性定義：每毫升組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50時所對應(yīng)的SOD量為1個SOD活力單位 (U)。GSH-PX活性定義：每0.1 mL組織蛋白在37℃反應(yīng)5分鐘，扣除非酶促反應(yīng)作用，是反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol/L為一個活力單位。CAT活性定義：每mg組織蛋白中CAT每秒鐘分解吸光度為0.5～0.55的底物中的CAT相對量為1個CAT的活力單位。Na+-K+-ATPase活性定義：每小時毫克蛋白分解ATP產(chǎn)生1 μmol無機(jī)磷的量為一個ATP酶活力單位。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS生物統(tǒng)計分析軟件，進(jìn)行單因素方差分析，檢驗(yàn)各取樣組間數(shù)據(jù)的差異顯著性，當(dāng)P ＜ 0. 05時為差異顯著。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 對仔魚的SOD的活性影響

分別對暴露在不同濃度下的藻細(xì)胞原液進(jìn)行4 d的仔魚染毒分析，研究不同暴露時間和不同濃度染毒下SOD酶活力的影響。由圖1可以看出，隨著暴露時間的延長，SOD的活性開始處于增加態(tài)勢 (P＜0.05)，到3 d后其活力最強(qiáng)，呈現(xiàn)出明顯的時間-效應(yīng)關(guān)系，但時間超過3 d后其活性又開始出現(xiàn)下降趨勢。與對照組相比，差異性均較顯著（P＜0.01）。此外，我們也看出，在試驗(yàn)時間進(jìn)行2 d內(nèi)，濃度越小其對SOD的誘導(dǎo)性越強(qiáng)，符合劑量—效應(yīng)關(guān)系，但到試驗(yàn)進(jìn)行到4 d后，開始表現(xiàn)出抑制作用，濃度越大其抑制作用越明顯，各濃度組與對照組相比其差異性較顯著 (P＜0.05)。

圖1 微小亞歷山大藻對黑鯛仔魚的SOD 酶活力的影響Fig. 1 Effects of Alexandrium minitum on the SOD activity in larvae of Sparus macrocephalus

2.2 對仔魚的GSH-PX的活性影響

經(jīng)不同濃度的微小亞歷山大 藻細(xì)胞原液處理后，仔魚的GSH-PX活性在整個實(shí)驗(yàn)期間發(fā)生一定的變化（見圖2）。由圖可以看出，從開始的2 d內(nèi)，藻液對仔魚的GSH-PX酶產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，使得酶活性呈現(xiàn)逐步增加的趨勢，活隨后到3 d以后又逐漸呈現(xiàn)下降趨勢，表現(xiàn)一定的抑制性。這種變化與對照組相比有一定差異，但不十分顯著(P＞0.05)。從各濃度組來看，劑量－反應(yīng)關(guān)系較明顯，濃度越大，受影響作用越明顯。

2.3 對仔魚的CAT的活性影響

黑鯛仔魚在藻細(xì)胞原液暴露1 d至2 d后，其CAT酶活性則呈現(xiàn)較明顯地增加，但這種誘導(dǎo)作用持續(xù)時間短暫，到試驗(yàn)進(jìn)行到3 d后，CAT酶活性則開始逐漸下降（圖3）。據(jù)圖3可見，黑鯛仔魚經(jīng)不同濃度的微小亞歷山大藻藻細(xì)胞原液染毒后，其CAT酶活性呈現(xiàn)出一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。對于越高的濃度，仔魚的CAT活性受到抑制作用就越強(qiáng)，但這種抑制作用相對于對照組較顯著（P＜0.05）。

圖2 微小亞歷山大藻對黑鯛仔魚的GSH-PX 酶活力的影響Fig. 2 Effects of Alexandrium minitum on the GSH-PX activity in larvae of Sparus macrocephalus

圖3 微小亞歷山大藻對黑鯛仔魚的CAT 酶活力的影響Fig. 3 Effects of Alexandrium minitum on the CAT activity in larvae of Sparus macrocephalus

2.4 對仔魚的Na+-K+-ATPase的活性影響

微小亞歷山大藻對黑鯛仔魚的Na+-K+-ATPase的活性影響結(jié)果見表1。相同時間內(nèi)，隨著藻液濃度的增加，仔魚的Na+-K+-ATPase的活性呈下降趨勢，表現(xiàn)為受到抑制作用。與對照組相比差異性較顯著，尤其是濃度為50 000 cell/mL時，達(dá)到極顯著水平( P ＜0.01)。在同組濃度下，仔魚的Na+-K+-ATPase的活性從試驗(yàn)開始第一天到第四天均出現(xiàn)不同程度的減少, 表現(xiàn)出時間-效應(yīng)關(guān)系。但對照組（0 cell/mL）的仔魚其Na+-K+-ATPase的活性則在實(shí)驗(yàn)開始的3 d內(nèi)，呈現(xiàn)逐步增加的趨勢，與實(shí)驗(yàn)濃度組呈現(xiàn)明顯的差異性(P＜0.01)。

表1 各濃度組Na+-K+-ATPase酶的活性水平（單位：μmolPi/mgprot/hour）Tab. 1 Effects of Alexandrium minitum with various concentrations on the activities of ATPase in the larvae of Sparus macrocephalus(μmolPi/mgprot/hour)

3 討論與結(jié)論

魚類生物在遭受污染物的脅迫作用時，為了免受自由基傷害，其體內(nèi)存在的抗氧化防御系統(tǒng)的抗氧化酶的發(fā)生活性或含量均會發(fā)生變化，這些抗氧化酶主要由SOD酶、GSH-PX酶和CAT酶等[8]。這些酶發(fā)生一系列的催化－歧化反應(yīng)，使得過氧化物還原為氧化物或消除細(xì)胞內(nèi)的氧自由基。當(dāng)高濃度藻液長時間作用于黑鯛仔魚后，產(chǎn)生了大量的活性氧中間體，超過了機(jī)體清除活性氧的能力。其結(jié)果是大量活性氧中間體作用于酶蛋白分子的關(guān)鍵性氨基酸殘基, 使酶活性受到抑制,使CAT上的2SH巰基氧化成SOS, 從而改變CAT酶的結(jié)構(gòu), 抑制其活性[9]。因而染毒試驗(yàn)中，所用的藻液濃度，隨著劑量的增加，黑鯛仔魚體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的酶活性受到的抑制作用就越強(qiáng)。

本實(shí)驗(yàn)表明，在低濃度的微小亞歷山大藻細(xì)胞原液（約10 000 cell/mL）脅迫下，黑鯛仔魚體內(nèi)的SOD酶、GSH-PX酶和CAT酶的活性均呈現(xiàn)先增加后減少的現(xiàn)象，SOD酶的活性峰值出現(xiàn)在染毒后的第3 d，GSH-PX酶和CAT酶的活性則在染毒后的第2 d達(dá)到峰值。一些學(xué)者在研究水環(huán)境污染物的過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)生物體受到輕度脅迫時,在短期內(nèi)機(jī)體組織的SOD、CAT及GSH-PX等酶的活力往往會升高[10]，本實(shí)驗(yàn)同樣出現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。這3種酶所表現(xiàn)出的受短暫時間的誘導(dǎo)作用可能是黑鯛仔魚對微小亞歷山大藻液脅迫的適應(yīng)階段，通過適應(yīng)性調(diào)節(jié)機(jī)體的相關(guān)生理機(jī)能活動，從而增強(qiáng)機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)清除活性氧自由基的能力。然而一旦藻液的脅迫程度超過黑鯛仔魚生理機(jī)能的適應(yīng)能力時，就會對仔魚抗氧化系統(tǒng)的功能造成傷害，進(jìn)而引起其功能水平的下降，最終可能造成活性氧自由基的積累和對細(xì)胞膜的損傷,降低生物的適應(yīng)能力和健康水平,從而啟動一系列的中毒反應(yīng)[11,12]。因而隨著時間的延續(xù)，仔魚體內(nèi)的SOD、GSH-PX和CAT的活性逐漸下降，證實(shí)了機(jī)體抗氧化功能可能受到損傷。

許多實(shí)驗(yàn)證明，Na+-K+-ATPase對環(huán)境中存在的多種有毒物質(zhì)敏感，它是這些毒物攻擊的靶點(diǎn)，并且這些毒物對Na-K-ATPase活性的抑制具有濃度和時間的依賴性[12]。在本實(shí)驗(yàn)中，黑鯛仔魚Na+-K+-ATPase酶活性最大值出現(xiàn)在試驗(yàn)開始的前期和低濃度的染毒組。表現(xiàn)出隨著微小亞歷山大藻染毒濃度的增加或染毒時間的延長，仔魚的Na+-K+-ATPase酶活性逐步下降，表明離子傳遞功能受到了抑制。Na+-K+-ATPase酶作為生物體內(nèi)重要的代謝酶之一，是細(xì)胞膜上主動轉(zhuǎn)運(yùn)離子的重要組成部分?？赏茰y仔魚的組織細(xì)胞受到損傷，導(dǎo)致細(xì)胞膜的生理功能減弱，從而使其體內(nèi)的能量運(yùn)輸阻斷，Na+、K+離子運(yùn)轉(zhuǎn)減慢，代謝產(chǎn)物大量堆積，酶活性的降低也導(dǎo)致仔魚組織細(xì)胞滲透壓調(diào)節(jié)能力降低[14]。

我們通過實(shí)驗(yàn)可以推測藻毒素所誘導(dǎo)的活性氧脅迫可能是黑鯛仔魚抗氧化酶活性受到影響的主要原因，由此影響體內(nèi)自由基的代謝平衡，引起魚體的其他生理功能下降。與上述3種抗氧化酶的活性變化相比，Na+-K+-ATPase酶活性對藻液的染毒環(huán)境反應(yīng)更為敏感，與藻液濃度存在明顯的劑量－效應(yīng)關(guān)系，其與上述3種酶的活力變化可以一起作為水體中藻液污染的生物指示器。

致謝：本次實(shí)驗(yàn)得到了江蘇水產(chǎn)所養(yǎng)殖基地、東海水產(chǎn)研究所的繆宇平副研究員、晁敏副研究員、馬繼臻同學(xué)的大力支持和幫助，在此表示感謝。

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Effects of Alexandrium minitum on the activities of the antioxidant system and ATPase of larvae of Sparus macrocephalus.

JIANG Mei1, HUANG Shi-lin2, LUN Feng-xia3, XIA Pei-yan4
(1. East China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fisheries Science, Shanghai 200090, China;2. The Second Institute of Oceanography, State Oceanic Administration, Hangzhou 310012, China;3. Shanghai General Hydrological Station，Shanghai 200232, China; 4. Shanghai Ocean University, Shanghai 200336, China)

In this article, we studied the change of superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-PX),peroxidase (CAT) and Na+-K+-ATPase activity of larvae of Sparus macrocephalus exposed to Alexandrium minitum algae liquid. It revealed that Alexandrium minitum algae liquid had obvious induction to the GSH-PX and CAT of larvae of Sparus macrocephalus in the early exposure stage, especially for the first two days. However, it showed inhibition effect in the following experiment after 2 days. Besides, Alexandrium minitum algae liquid showed strong induction effect to SOD for the first 3 days then changed to the inhibition effect. The obvious dose- response link between the concentration of exposed algae solution and the activity of SOD, GSH-PX and CAT showed that the higher the concentration of algae solution, the lower the inhibition and the greater the biological toxicity. However, the strong inhibition of algae solution to Na+-K+-ATPase displayed concentration-response link. The four enzyme’s activity changes of the larvae of Sparus macrocephalus studied in this paper can work as the biological indicator of algae pollution in water.

Alexandrium minitum; larvae; antioxidant system; ATPase

S965.3；Q143

A

1001-6932(2010)04-0427-05

2009-08-28；

2009-11-17

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃“973”項(xiàng)目資助（G2010CB428705）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所）(2007M08)；上海市科委“登山行動計劃”項(xiàng)目 (06dz2015)

蔣玫 (1973－)，女，副研究員，主要從事漁業(yè)早期生態(tài)研究及海洋環(huán)境保護(hù)與影響評價。電子郵箱：jiangrose73@sina.com