魚(yú)腥草中槲皮素提取方法的研究

吳景林

(四川利豐化工有限責(zé)任公司,成都,610041)

魚(yú)腥草中槲皮素提取方法的研究

吳景林

(四川利豐化工有限責(zé)任公司,成都,610041)

本試驗(yàn)通過(guò)不同提取試劑和提取方式,以槲皮素含量作為指標(biāo),對(duì)魚(yú)腥草中槲皮素提取率的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,最佳提取條件參數(shù)為:提取試劑(乙醇:25%鹽酸=4:1),超聲波提取50min。該方法操作簡(jiǎn)捷、迅速、準(zhǔn)確、提取率高,為魚(yú)腥草的槲皮素提取提供了一種有效的方法。

魚(yú)腥草 槲皮素 提取方法 高效液相色譜 含量測(cè)定

魚(yú)腥草為三白草科蕺菜屬植物蕺菜(Houttuynia Co rdata Thunb.)的帶根全草,主要分布于我國(guó)中部、東南及西南部各省區(qū),東起臺(tái)灣,西南至云南、西藏,北達(dá)陜西、甘肅,尤以四川、湖北、湖南、江蘇等省居多。常生于海拔300-2600米的山坡潮濕林下、路旁、田埂及溝邊。

槲皮素是魚(yú)腥草中一種重要的黃酮類(lèi)化合物,具有很高藥用價(jià)值。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,槲皮素對(duì)缺血再灌性心律失常有保護(hù)作用;能降低血壓,增強(qiáng)毛細(xì)血管抵抗力,減少毛細(xì)血管脂性,降血脂,擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈,增加冠脈血流量;增強(qiáng)心肌收縮力;舒張腸平滑肌,降低血壓,降低膽固醇,降低血小板膜脂質(zhì)流動(dòng)性;具有免疫抑制和抗過(guò)敏作用,抗癌防癌作用;祛痰、止咳、平喘作用[1-5]。

槲皮素的研究越來(lái)越受到人們的重視,對(duì)于魚(yú)腥草中槲皮素高效液相色譜測(cè)定方法不多,劉文饒等人采用5%硫酸乙醇加熱回流提取,測(cè)定了不同產(chǎn)地魚(yú)腥草中槲皮素的含量[6]。但是回流提取方法繁瑣,操作復(fù)雜,且需要4個(gè)小時(shí)。因此,本試驗(yàn)考察了不同溶劑不同提取方式對(duì)槲皮素提取率的影響,力圖尋找一種適合魚(yú)腥草中槲皮素提取的快速、簡(jiǎn)捷、準(zhǔn)確的最佳方案,為魚(yú)腥草的化學(xué)成分提取工藝提供一種新的思路。

1 儀器與材料

1.1 材料、儀器與試藥

試驗(yàn)材料經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院吳衛(wèi)博士鑒定為 Houttuynia Co rdata Thunb.。

儀器為Agilent公司1100型高效液相色譜儀(含脫氣機(jī)、四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣、柱溫箱、DAD檢測(cè)器),Sartorius公司BP211D型電子天平, ICE公司 M icromax型離心機(jī),M illipope公司M illiQ型純水儀,Autoscience公司溶劑過(guò)濾器,Labarey公司微量移液器,超聲波清洗機(jī),搖擺式中藥粉粹機(jī)。

試藥乙腈為色譜純,由 TED IA公司提供,槲皮素對(duì)照品(純度>98%)由Sigma公司提供,其余試劑為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 預(yù)處理

將魚(yú)腥草干草在60℃烘箱干燥2小時(shí)左右,粉碎過(guò)篩(40目),收集細(xì)粉備用。

1.2.2 測(cè)定條件

色譜柱:Hypersil ODS C18 5μm 4.0mm× 250mm;流動(dòng)相:乙腈:0.4%磷酸=45:55,調(diào)p H值=3;流速:1.0m l/m in;柱溫:30℃;紫外檢測(cè)波長(zhǎng): 370nm。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

精密稱(chēng)取槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品0.0224g,用分析純無(wú)水乙醇定溶于 50m l的容量瓶中溶解,制成224.3μg/m l的標(biāo)準(zhǔn)溶液,再將其稀釋成22.43μg/ m l的標(biāo)準(zhǔn)溶液。1.2.4 槲皮素含量測(cè)定

精密稱(chēng)取過(guò)目后的細(xì)粉1.00g,倒入50m l的三角瓶中,加入不同溶劑配比的提取液約40m l,然后用不同提取方法提取。取出后趁熱過(guò)濾,濾干后用提取液洗滌殘?jiān)鼣?shù)次,直到把濾紙洗白為止,然后定容至 50m l。取 1.0m l至 1.5m l于離心管中,在10000轉(zhuǎn)/min條件下離心10min,移取上清液作為供試品溶液。準(zhǔn)確吸取供試品溶液5μl,注入高效液相色譜儀,按上述色譜進(jìn)行測(cè)定。

槲皮素的含量(mg/g)=(單位峰面積槲皮素含量(mg)×峰面積積分值×50m l)/(5μl×魚(yú)腥草細(xì)粉重(g)×1000×1000)

1.2.5 提取方法

本實(shí)驗(yàn)采用回流提取與超聲提取方式,分別加入不同配比的溶劑進(jìn)行提取,共10個(gè)處理,不同提取方式和試劑配比見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 含量測(cè)定的方法學(xué)考察

槲皮素對(duì)照及供試樣品分離色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 線性范圍

取濃度為22.43μg/m l和224.3μg/m l的槲皮素對(duì)照品溶液,分別進(jìn)樣1、2、5、10μl,按上述色譜條件測(cè)定,以峰面積為縱坐標(biāo),槲皮素濃度(μg/m l)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算得回歸方程為:y= 1.2615x-16.1218(r=0.9997)。表明槲皮素含量在22.43ng～2243ng 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.1.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取22.43μg/m l對(duì)照品溶液5μl,重復(fù)進(jìn)樣5次,槲皮素峰面積積分值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD =0.30%。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取22.43μg/m l對(duì)照品及供試樣品溶液5μl,分別在0、3、6、9h進(jìn)樣測(cè)定,對(duì)照品和供試樣品的槲皮素峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為0.96%和0.99%。結(jié)果表明,對(duì)照品及供試樣品在9h內(nèi)有良好的穩(wěn)定性。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取魚(yú)腥草粉末1.00g,共6份,采用優(yōu)選方法(乙醇:25%鹽酸=4:1,超聲提取)進(jìn)行提取測(cè)定槲皮素含量,槲皮素含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD= 1.61%。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)

2.1.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量的魚(yú)腥草樣品1.00g,分別加入槲皮素對(duì)照品,回收率結(jié)果見(jiàn)表5,從表中可以看出,平均回收率為101.19%,RSD為2.35%(n= 6)。說(shuō)明此方法回收性良好。

表5 回收率實(shí)驗(yàn)

2.2 提取溶劑的確定

本試驗(yàn)以甲醇和乙醇為提取試劑,25%鹽酸和5%硫酸為水解試劑,兩者按一定比例混合。結(jié)果表明,選擇甲醇與鹽酸混合試劑的槲皮素最高含量為2.8877m g/g,而乙醇與鹽酸混合試劑的最高含量為2.7071mg/g,甲醇稍高于乙醇,但兩者差異不大。

2.3 提取方法的確定

本試驗(yàn)分別采用回流和超聲兩種提取方法對(duì)提取效率進(jìn)行了比較。結(jié)果表明,回流提取的最高含量為2.8877mg/g,超聲提取最高含量為2.7071mg/g,兩種提取方式中回流稍高于超聲提取。

2.4 最佳提取條件的篩選

不同提取方法提取魚(yú)腥草的槲皮素含量結(jié)果(每個(gè)處理3次重復(fù))見(jiàn)表6,從表中可以看出,不同提取方法得到的槲皮素含量不盡相同,含量最高的為處理1(甲醇:25%鹽酸=4:1回流提取),含量達(dá)2.8877mg/g,其次為處理9(乙醇:25%鹽酸=4:1超聲提取),含量為2.7071mg/g。不同提取方法的方差分析結(jié)果見(jiàn)表7。從中可以看出,不同試劑間差異極顯著,提取方式間的差異不顯著,提取試劑與提取方式之間的互作不顯著,說(shuō)明該試驗(yàn)主要受單因素(提取試劑)影響。

表6 不同提取方法的魚(yú)腥草槲皮素含量

表7 不同提取方法提取魚(yú)腥草槲皮素含量結(jié)果的方差分析

為了尋找最佳組合,采用新復(fù)極差法(duncan多重比較)進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)驗(yàn)(見(jiàn)表8)。從表中可以看出,處理1的提取率最高,含量達(dá)到2.8877mg/g,處理8的提取率最低,含量低至1.2804mg/g,處理1的提取率極顯著高于處理8;處理1、2、3之間具有極顯著差異,處理8的提取率顯著低于其他處理,說(shuō)明提取率受甲醇濃度的影響較大,甲醇的濃度越大,槲皮素的提取率越高;處理5、10采用的是5%硫酸作為水解試劑,與其他處理組合相比較,差異不顯著,說(shuō)明水解試劑無(wú)論是25%的鹽酸還是5%硫酸均能將魚(yú)腥草中的槲皮素苷元類(lèi)黃酮苷水解為苷元,硫酸與鹽酸相比較,從安全和經(jīng)濟(jì)上考慮,優(yōu)選鹽酸作為水解試劑;處理4、5、9、10采用的是乙醇,其他處理均采用的是甲醇,甲醇乙醇之間差異不顯著,說(shuō)明甲醇乙醇均可以作為槲皮素的提取試劑,均能將槲皮素提取完全,但甲醇有毒,且價(jià)格比乙醇更昂貴,從安全和經(jīng)濟(jì)上考慮,宜選用乙醇作為提取試劑;從提取方式上考察,回流提取的提取率要稍?xún)?yōu)于超聲提取,但兩者差異不顯著,超聲提取方式更簡(jiǎn)捷,快速。綜合以上因素,我們選擇處理9,即采用乙醇:25%鹽酸=4:1作為提取試劑,超聲提取。

表8 不同提取方法提取魚(yú)腥草槲皮素含量結(jié)果的Duncan多重比較

3 討論與結(jié)論

(1)通過(guò)本次試驗(yàn),我們找到了一種魚(yú)腥草中槲皮素提取的適宜方法,即采用乙醇:25%鹽酸=4:1作為提取試劑,超聲提取,該方法簡(jiǎn)捷快速準(zhǔn)確可靠。同時(shí),通過(guò)方法學(xué)考察,驗(yàn)證了劉文饒等人[6]采用高效液相色譜法測(cè)定魚(yú)腥草中槲皮素含量試驗(yàn)的可靠性。

(2)回流與超聲提取均能將魚(yú)腥草中的槲皮素提取完全,回流的提取率稍高于超聲提取,本試驗(yàn)所得出的結(jié)論與王暉等人在進(jìn)行透骨草中槲皮素含量測(cè)定的實(shí)驗(yàn)中[7]的結(jié)論基本一致,我們選擇超聲提取是為了節(jié)省時(shí)間和工作量,并且超聲提取更節(jié)省能源,既快捷簡(jiǎn)便又經(jīng)濟(jì)。

(3)周軍輝等人在測(cè)定不同產(chǎn)地紫菀中槲皮素的含量時(shí)采用了超聲提取,考察了超聲時(shí)間對(duì)提取的影響,結(jié)果顯示超聲提取50min為佳[8]。本試驗(yàn)同樣選擇50m in,處理20m in后,為了避免樣品過(guò)熱和保護(hù)超聲波清洗機(jī),間隔10min后再處理20min。共耗時(shí)50m in,處理時(shí)間對(duì)提取率的具體影響還有待進(jìn)一步研究。

(4)甲醇與乙醇都能夠?qū)Ⅳ~(yú)腥草中槲皮素提取充分,周軍輝等人認(rèn)為甲醇提取效果更好[8],通過(guò)本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),甲醇乙醇之間的差異不顯著,選擇二者均可,但從安全和經(jīng)濟(jì)角度考慮,選擇乙醇更為適宜。

[1]李云峰.槲皮素代謝的研究進(jìn)展[J].生理科學(xué)進(jìn)展,2002,33 (1):53-55.

[2]宋玉嬌,姚凌云,曹蔚,等.槲皮素的藥理作用研究近況[J].西北藥學(xué)雜志,2002,17(1):40-42.

[3]林蓉,劉俊田,李旭,等.槲皮素對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)循環(huán)雜志,2000,15(5):304-305.

[4]張敏.槲皮素與5-FU對(duì)兩種人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞株細(xì)胞抑制作用的相互關(guān)系[J].新醫(yī)藥-植物藥分冊(cè),1996,11(3):127.

[5]張瓊,徐明娟,宋亮年,等.槲皮素對(duì)人卵巢癌細(xì)胞系增殖的影響[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),1999,20(6):380-382.

[6]劉文堯,梁愛(ài)君,白皓,等.高效液相色譜法測(cè)定魚(yú)腥草中槲皮素的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),1999,15(6):40-41.

[7]王暉,劉良玉.HPLC法測(cè)定透骨草中槲皮素的含量[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2005,17(4):41.

[8]周軍輝,王答祺,孫文基,等.HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地紫菀中槲皮素的含量[J].西北藥學(xué)雜志,2006,21(1):12-13.

Abstract:On the index of content of quercetin in Houttuynia co rdata Thunb.,the op tim um extracting reagent and method was investigated in thisexperiment.The result showed that the extracting reagent is CH3CH2OH:25%HCl=4:1,and ultrasonic extracting fo r 50 min w ere op timal parameter.The method w as simp le,quick,accurate and high extracted rate,w hich was an effective method for extracting quercetin in H.co rdata.

Key words:houttuynia cordata thunb.;quercetin;extracting method;HPLC;content determination

Study on Extracting Method of Quercetin in Houttuynia Cordata Thunb.

W u Jing lin
(Sichuan L ifeng Chem ical CO.L TD,chengdu,610041)