CO2/空氣比值對牟氏角毛藻生長和總脂含量的影響

王 蒙 ，李純厚 ，戴 明 ，韋芳三 ，周巖巖 ，楊慧英，胡維安，楊 進

（1.中國水產科學研究院南海水產研究所，農業(yè)部海水養(yǎng)殖生態(tài)與質量控制重點開放實驗室，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學，上海 201306）

牟氏角毛藻（Chaetoceros miielleri）隸屬硅藻門（Bacillariohyta）盒形藻目（Biddulphiales）[3]，其體積小、細胞壁薄、耐高溫、繁殖速度快、抗污染能力強，多數單個生活，有時2～3個組成群體。其所含營養(yǎng)豐富，適于蝦類、蟹類以及泥蚶、牡蠣等貝類幼體攝食和消化[4]，且在溫度為10～39℃環(huán)境下均能生長繁殖，是海產經濟動物的良好餌料生物。與其他單胞藻相比，牟氏角毛藻藻體內含有大量的脂肪酸、蛋白質等營養(yǎng)物質，近年來引起人們的廣泛研究[5-9]。

蔣霞敏[10]研究指出，外界培養(yǎng)條件的變化（如養(yǎng)分、光照、溫度、鹽度等）均會影響微藻細胞的生長及其脂肪酸的含量與組成。豐富的碳源有利于積累更多的油脂[11]，C/N比對微藻油脂合成也有顯著影響[12]。CO2的來源廣泛，利用CO2促進微藻細胞的生長，具有良好的經濟效益。光合作用以CO2作為基質消耗，引起pH變化，采用添加大量的NaHCO3會導致海水中多種重要離子的沉淀[8,13-14]并使生產成本提高。5%濃度的CO2對微藻的光合作用特征及固碳機制的影響，已有廣泛的研究[8,15-16]。CO2及CO2通入方式對微藻生長速度及細胞密度的影響近年來也有報道，但通入的CO2與空氣的比例對微藻相對生長率和總脂含量百分比的研究卻很少。本文旨在探索牟氏角毛藻作為生物燃料的原材料的可行性，通過控制培養(yǎng)過程中通入的CO2/空氣比值的大小，刺激藻體內乙酰-COA（Acetyl-COA）和NADPH的生產，使其積累更多的油脂，以提高牟氏角毛藻的總脂含量。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗于2009年9～11月在南海水產研究所深圳實驗基地進行，牟氏角毛藻藻種由中國水產科學院南海水產研究所水產種質資源與養(yǎng)殖技術重點開放實驗室提供。試驗用藥品全部為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)用水、培養(yǎng)液配方和培養(yǎng)容器 培養(yǎng)用海水全部取自深圳市楊梅坑海域，鹽度約為30.6，加入消毒淡水將鹽度調至20。依次經遮光沉淀，過濾棉、脫脂棉、300目篩網過濾，煮沸消毒。以消毒海水為基礎，加入一定的營養(yǎng)鹽配成培養(yǎng)液，基礎培養(yǎng)液成分[17]見表1。在本試驗中將培養(yǎng)液中NaHCO3的濃度調為5.75 g/L，培養(yǎng)容器為Corning 1 L扁形玻璃培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)液體積為800 mL。試驗前用1%稀鹽酸溶液浸泡、洗滌、120℃高溫消毒1 h，冷卻備用。

表1 基礎培養(yǎng)基配方 （g/L）

1.2.2 培養(yǎng)方法與日常管理 試驗設置5個梯度的CO2/空氣比值，分別為A處理，1/5；B處理，1/10；C 處理，1/15；D 處理，1/20；E 處理，1/25；以不通氣體作為空白對照組。試驗時采用單種培養(yǎng)，試驗藻在85-2恒溫磁力加熱攪拌器上培養(yǎng)，攪拌速度約200 r/min；溫度設定為26℃；采用6只40 W燈管并排放置的方法全天24 h光照，光照強度約為4 000 lx（上海市嘉定學聯(lián)JD-3照度計）；培養(yǎng)液鹽度為20，pH控制為7.8～8.5。用直徑5 mm的玻璃管勻速通入CO2與空氣的混合氣體，每個梯度設置3個平行。每24 h從培養(yǎng)瓶中取出約2/3倒入5 L塑料桶中繼續(xù)培養(yǎng)備用，然后再加入新的培養(yǎng)液，即半連續(xù)培養(yǎng)。

1.3 計數

每日上午8點到10點擴藻，擴藻前后分別取樣一次，采用KB-K-25血球計數板計數，每個樣計數2～3次，取平均值并分別計算牟氏角毛藻每個梯度、每個平行培養(yǎng)瓶擴前擴后的細胞密度，計算相對生長率。

1.4 采收與提取

待塑料桶中的牟氏角毛藻生長至指數生長期末期[18]（此時脂肪酸積累程度最高），用離心機（上海安亭LXJ-IIB）4 500 r/min離心15 min濃縮藻液，棄去上清液后的藻泥用消毒淡水清洗2～3次，并將藻泥置于鼓風干燥箱中45℃干燥至恒重備用。參照文獻[19]，將干燥后的藻泥稱重并用脫脂棉包好裝入卷好的濾紙筒，再將濾紙筒放入提取筒中，連接好接收瓶和冷凝管，并用鐵架臺固定。加入無水乙醚至接收瓶容積的2/3，60℃水浴加熱，索氏提取法提取體內的粗脂肪。提取后的濾紙筒烘干至恒重，準確稱量提取前后干濾紙筒的重量，兩者之差即為粗脂肪的重量，進而計算出該梯度條件下粗脂肪的含量。只需更換濾紙包即可進行下一次測定，可連續(xù)操作，方法簡單經濟，能得到較好的平行結果。

一般來說,對同一量子態(tài)進行測量時,正定算子值測量之矩陣的階僅是投影測量之矩陣的階的一半[7-8,43]。這表明:就同一量子任務而言,采用正定算子值測量的協(xié)議比采用投影測量的協(xié)議更簡單且易于實驗實現(xiàn)。本節(jié),我們通過用正定算子值測量代替上節(jié)中的投影測量U1,達到改進上述方案的目的。

1.5 計算方法

1.5.1 相對生長率 計算公式為：

其中Κ代表生長率，Nt為試驗進行到t天擴藻前的細胞密度，N0為t0天時擴藻后的細胞密度，t0＜t。

1.5.2 總脂含量百分比 計算公式為：

其中P代表總脂含量百分比，n代表粗脂肪總重，m代表樣品藻的干重。

1.5.3 總脂日增量 假設樣品藻初始干重為a g，P代表總脂含量百分比，且在相同生長條件下P不變，則生長一天后，藻液中的藻干重為2Ka g，藻中粗脂肪的總重量為2Ka·Pg，所以總脂日增量的計算公式為：

1.6 保種

本文采用的是固定化[20]保存方法，方法如下：稱取2.5 g海藻酸鈉，溶入100 mL蒸餾水中，并加入2 g氯化鈉，攪動加熱至成為均勻的粘稠狀膠體停止加熱，此即為固定化所需的海藻酸鈉凝膠溶液。將濃縮后的藻細胞懸浮液與海藻酸鈉凝膠溶液按1∶4的比例充分混勻，制成膠－藻混懸液；取20 mL注射器、9號針頭吸取混懸液，勻速擠入2%氯化鈣溶液中，玻璃棒迅速攪拌均勻。用消毒海水沖洗2次，以除去殘余的氯化鈣溶液，不添加培養(yǎng)液，置于冰箱中4℃冷藏。

1.7 脂肪酸的成分分析

利用GC/MS面積歸一化法（JY/T 003-1996）對藻類提取出的脂肪酸進行成分分析。

2 結果與分析

2.1 CO2/空氣比值對牟氏角毛藻生長的影響

采用上述試驗方法培養(yǎng)牟氏角毛藻，根據每天的細胞計數，計算每個梯度下藻的初始密度、終密度、相對生長率。該藻在本試驗方法培養(yǎng)過程中，始終處于指數生長期，經觀察，指數生長期可維持15～20 d。

圖1顯示不同的CO2/空氣條件下牟氏角毛藻培養(yǎng)24 h前后細胞密度的變化情況。從圖可知，牟氏角毛藻的最高終密度為15.35×106cell/mL，最低為10.67×106cell/mL；當CO2/空氣=1/15時藻的密度變化比較明顯，說明CO2/空氣比值為1/15的條件適合牟氏角毛藻的生長。

圖2顯示在不同的CO2/空氣條件下，牟氏角毛藻相對生長率的大小。圖中顯示CO2/空氣=1/15時，該藻的相對生長率平均值最高，達1.76 d-1；其中CO2/空氣=1/25時，相對生長率平均值相對于其他梯度較低，而對照組則最低。方差分析顯示，CO2/空氣比值對牟氏角毛藻相對生長率影響極顯著（F=15.441，p<0.01），其中對照組與5個CO2/空氣梯度

圖1 CO2/空氣比值對藻密度的影響

圖2 CO2/空氣比值對藻相對生長率的影響

（同一指標的不同小寫字母標注表示差異達顯著水平，下同。）之間差異極顯著（p<0.01），E與B、E與 C、C與D之間差異也是極顯著（p<0.01），A與E、B與D之間差異顯著（0.010.05）。

2.2 CO2/空氣比值對牟氏角毛藻總脂含量百分比的影響

從圖3中可知，CO2/空氣=1/15時牟氏角毛藻的總脂含量百分比最高。方差分析顯示，CO2/空氣比對牟氏角毛藻總脂含量影響極顯著（F=76.524，p<0.01），其中對照組與5個梯度之間差異均極顯著（p<0.01），A與C、A與E、B與C之間差異也極顯著（p<0.01），A與D、C與D之間差異顯著（0.010.05）。這說明5個CO2/空氣梯度對牟氏角毛藻的脂肪積累都有較大提高，且CO2/空氣=1/15時最明顯。

2.3 CO2/空氣比值對牟氏角毛藻總脂日增量的影響

根據公式分別計算5個CO2/空氣比值培養(yǎng)條件下總脂日增量的大小，結果見圖4。CO2/空氣比值對牟氏角毛藻總脂日增量影響極顯著（F=38.431，p<0.01），其中對照組與5個梯度之間差異均極顯著（p<0.01），A與C、B與E、C與D、C 與 E 之間差異也極顯著（p<0.01），A與E、B與C、B與D之間差異顯著（0.010.05）。

圖3 CO2/空氣比值對總脂含量百分比的影響

圖4 CO2/空氣比值對總脂日增量的影響

牟氏角毛藻在5個CO2/空氣梯度條件下，總脂日增量的變化與相對生長率的變化趨勢相似，這說明相對生長率的大小與總脂日增量的關系密切，在藻種的總脂含量百分比相差不懸殊的情況下，相對生長率越大，總脂日增量也越大。

2.4 CO2/空氣比值對牟氏角毛藻脂肪酸組成的影響

每個梯度取一個樣本，用1.7中方法測定脂肪酸的組成，不同CO2/空氣比值下，牟氏角毛藻脂肪酸含量見表2。

表2 不同的CO2/空氣比值下牟氏角毛藻的脂肪酸組成（%）

從表2中可知，經不同CO2/空氣比值的混合氣體培養(yǎng)，總不飽和脂肪酸的量范圍在65.28%～70.27%之間，平均為68.81%，比不通空氣的對照組提高了9.48個百分點。牟氏角毛藻的總不飽和脂肪酸的含量隨CO2/空氣比值的減小而增加，總飽和脂肪酸的量則呈降低趨勢。

3 結論

據袁有憲[21]、王侃等[22]報道，利用普通的搖瓶方法培養(yǎng)牟氏角毛藻，最高密度為4.8×106cell/mL；鄒寧等[23]指出，在生物反應器中牟氏角毛藻的密度最高為10×106cell/mL。本研究表明，牟氏角毛藻終密度最高達到15.35×106cell/mL），是袁有憲、王侃等人培養(yǎng)密度的3.20倍，是鄒寧在生物反應器中培養(yǎng)的1.54倍；終密度最低為10.67×106cell/mL，是前人研究的1.05～2.19倍。而在如此高的密度下，牟氏角毛藻完全可以抑制弧菌等細菌的生長[24]。從現(xiàn)有的報道來看，培養(yǎng)牟氏角毛藻時相對生長率都小于1.2 d-1；胡晗華、高坤山[8]報道了在CO2濃度倍增情況下，牟氏角毛藻的最大生長率為0.47 d-1，本研究中相對生長率在1.39～1.76 d-1范圍內，對照組中相對生長率為1.04 d-1，可見通入不同CO2/空氣比值的混合氣體能使牟氏角毛藻生長速度加快。

蔣霞敏等[25]報道了牟氏角毛藻的總脂含量百分比為15.07%，而經過本方法培養(yǎng)，測得該藻的總脂含量百分比有了極大的提高，在CO2/空氣=1/15時最高，達到31.25%，將牟氏角毛藻的粗脂肪含量提高了16.18個百分點；在CO2/空氣=1/5時最低為28.52%，仍比報道的高13.45個百分點。結果顯示，CO2/空氣比值在1/5～1/25之間時，牟氏角毛藻的總脂含量百分比先隨比值的減小而升高，1/15之后又有所下降，但趨于平緩，說明牟氏角毛藻在CO2/空氣=1/15時，牟氏角毛藻體內的乙酰輔酶A羧化酶（ACC）和NADPH的生成影響顯著，有機體積累油脂的能力最強。可見，通入CO2/空氣比值為1/15的混合氣體適合牟氏角毛藻的生長與粗脂肪積累，這也為培養(yǎng)其他種類產能微藻提供一個借鑒方法。

研究表明，CO2/空氣=1/15時，總脂日增量最高，達樣品藻初始干重的0.75倍。根據總脂日增量與相對生長率、總脂含量百分比的函數，筆者認為總脂日增量與相對生長率和總脂含量百分比均有聯(lián)系，與相對生長率的關系最為密切。因此，牟氏角毛藻產油量最高的最適CO2/空氣比值為1/15。但在實際培養(yǎng)過程中，要根據藻不同的生活習性通入不同的CO2/空氣的混合氣體，使相對生長率與總脂含量百分比達到完美的結合，從而達到高產油量的目的。

李荷芳[26]研究認為，硅藻的主要脂肪酸為、和，占總脂肪酸含量的 74.6%～83.1%。硅藻綱脂肪酸組成的特點是的含量高于，并有高水平的另一個特點是含有較高含量的根據本研究結果，牟氏角毛藻的主要脂肪酸為和有高水平的含有較高含量的，這與李荷芳的研究結果相似。的含量基本上低于，與李荷芳的研究結果不一致。王海英[27]研究指出，牟氏角毛藻體內總飽和脂肪酸占40.5%，總不飽和脂肪酸的含量為54%。本研究發(fā)現(xiàn)，牟氏角毛藻體內總飽和脂肪酸的含量為29.73%～34.72%，低于王海英的研究結論。這些結果的產生與本研究的培養(yǎng)方法以及提取方法有一定的關系，還需做進一步研究。

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