蘇云金芽孢桿菌生物殺蟲劑發(fā)酵生產(chǎn)的影響因素及其工藝選擇

常明，孫啟宏，周順桂，倪晉仁

1. 中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院，北京 100012；2. 北京大學(xué)環(huán)境工程系//教育部水沙科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100871；3. 廣東省農(nóng)業(yè)環(huán)境綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室//廣東省生態(tài)環(huán)境與土壤研究所，廣州 510650

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis, Bt）簡(jiǎn)稱蘇云金桿菌，是一類能在代謝過程中產(chǎn)生芽孢和伴孢晶體的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，其制劑是目前世界上產(chǎn)量最大的微生物殺蟲劑[1]。自1901年日本學(xué)者石渡繁胤（Ishiwata）從病死家蠶中分離出第一株蘇云金芽孢桿菌以來(lái)，全世界已分離出了 71個(gè)血清型86個(gè)亞種。其殺蟲譜已由無(wú)脊椎動(dòng)物節(jié)肢動(dòng)物門中的鱗翅目擴(kuò)大到雙翅目、鞘翅目、直翅目等9個(gè)目的昆蟲；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)對(duì)螨類、線形動(dòng)物門中的動(dòng)植物寄生線蟲、原生動(dòng)物門中的鞭毛蟲、變形蟲和草履蟲以及扁形動(dòng)物門中的扁蟲、吸蟲、絳蟲等有特異毒性的菌株[2]。目前不少亞種已被成功應(yīng)用于農(nóng)業(yè)，用來(lái)防治糧食作物、蔬菜、棉花、大豆、煙草、果樹等多種害蟲。

Bt制劑的主要?dú)⑾x活性成分是伴孢晶體（亦稱殺蟲晶體蛋白或 δ-內(nèi)毒素）。殺蟲晶體蛋白（Insecticide Crystal Proteins, ICPs）可占培養(yǎng)物生物量總干重的 20%~30%，分子量在 27~150 kDa之間[3]。Bt的殺蟲機(jī)制為：伴孢晶體被昆蟲吞食后，在中腸的堿性環(huán)境和蛋白酶的作用下δ-內(nèi)毒素被分解與激活，成為具有殺蟲活性的毒性肽。毒性肽與幼蟲腸上皮細(xì)胞膜的專一受體結(jié)合，導(dǎo)致膜穿孔，腸道內(nèi)溶物滲入血腔，同時(shí)芽孢趁機(jī)侵入增殖，引起足以致死的敗血癥，導(dǎo)致昆蟲全身麻痹或痙攣而死[4]。近幾十年來(lái)，人們對(duì)Bt的發(fā)酵生產(chǎn)展開了大量研究，并已形成了較為成熟的生產(chǎn)工藝。本文提煉了國(guó)內(nèi)外眾多研究者的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，希望通過對(duì)發(fā)酵影響因素的分析與發(fā)酵工藝發(fā)展的探討為 Bt生物殺蟲劑的進(jìn)一步開發(fā)與應(yīng)用提供參考。

1 蘇云金桿菌發(fā)酵生產(chǎn)的影響因素

1.1 培養(yǎng)條件

1.1.1 溫度

Bt的生長(zhǎng)代謝與溫度密切相關(guān)。溫度直接影響細(xì)胞內(nèi)酶的形成與活性，關(guān)系到細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收與利用，并影響到菌體數(shù)量與伴孢晶體質(zhì)量。大量研究表明，Bt的最適生長(zhǎng)溫度為28~32 ℃，發(fā)酵時(shí)溫度過高，會(huì)導(dǎo)致Bt毒素基因丟失或蛋白失活，毒效降低；溫度過低，則生長(zhǎng)緩慢，發(fā)酵周期延長(zhǎng)[5]。另外，細(xì)胞生長(zhǎng)最適溫度與晶體蛋白中各基因合成的最適溫度有時(shí)會(huì)存在一定差異。Melek ?zkan等人考查了溫度對(duì)Bt subsp. israelensis HD500蛋白基因合成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cry4Ba在25 ℃時(shí)含量最高，而菌體生長(zhǎng)及Cry11Aa合成的最適溫度分別是37 ℃和30 ℃[6]。不同蘇云金亞種甚至同一亞種的不同菌株，其最佳發(fā)酵溫度亦有所不同，發(fā)酵時(shí)需針對(duì)菌株特性選擇最具經(jīng)濟(jì)效率的溫度。

1.1.2 pH值

pH不僅影響芽孢的萌發(fā)，也影響芽孢的形成。研究表明，初始pH值為7.0左右時(shí)，芽孢萌發(fā)率最高，當(dāng)pH值<6.5或>8.0時(shí)，萌發(fā)率均在45%以下[1]。發(fā)酵過程中，Bt先利用碳源增殖，糖代謝產(chǎn)生大量有機(jī)酸，pH下降，隨后在酶的作用下，有機(jī)酸進(jìn)一步被異化，pH值逐漸回升，芽孢與晶體開始形成。伴孢晶體的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化合成過程需要酶的參與，而這種酶的合成與酶活最適pH均為中性，pH值在6.5以下或9.1以上該酶的活性急劇下降。若pH不能回升，芽孢和晶體難于形成[7]，若pH值過早升高，又會(huì)使?fàn)I養(yǎng)體增殖提前結(jié)束，影響到芽孢和晶體的產(chǎn)量。另外，過高的堿性對(duì)伴孢晶體還有一定的溶解作用，會(huì)降低發(fā)酵液的毒效。發(fā)酵過程中可以流加緩沖液，或采用酸堿進(jìn)行調(diào)解，以控制最佳pH值。Khanh Dang Vu等人采用NaOH/H2SO4、NaOH/CH3COOH、NH4OH/CH3COOH和NH4OH/H2SO44種酸堿組合對(duì)淀粉廢水培養(yǎng)Bt var.kurstaki HD-1的發(fā)酵過程進(jìn)行調(diào)節(jié)，使pH值保持在7.0±0.1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以NaOH/H2SO4和NH4OH/H2SO4為pH調(diào)節(jié)劑對(duì)堿性蛋白酶和淀粉酶的產(chǎn)生十分有利，而以NaOH/CH3COOH為pH調(diào)節(jié)劑可顯著提高晶體蛋白產(chǎn)量和毒效[8]。由此可見，采用適宜的pH調(diào)節(jié)劑，對(duì)Bt的發(fā)酵過程進(jìn)行有效調(diào)控，是Bt發(fā)酵生產(chǎn)的關(guān)鍵因素。

1.1.3 攪拌速度與通氣量

Bt是一種好氣性芽孢桿菌，在分解和利用發(fā)酵基質(zhì)以及合成自身物質(zhì)時(shí)要消耗大量氧。如：1摩爾葡萄糖完全氧化為CO2和H2O需要6摩爾氧。發(fā)酵培養(yǎng)基中糖的含量可達(dá)1%，但氧的含量卻很低，飽和濃度也只有0.007%。因此隨著細(xì)菌的生長(zhǎng)，必須不斷補(bǔ)充大量的氧才能滿足菌體的正常生長(zhǎng)。同時(shí)氧的存在也可提供一個(gè)較高的氧化還原電位，維持細(xì)胞內(nèi)氧化酶系的活性[1]。毒素合成機(jī)制也受供氧影響[9]，F(xiàn)oda等人通過改變裝液量考查了供氧對(duì)Bt subsp. entomocidus HD-635的影響。發(fā)現(xiàn)供氧受限時(shí)（空氣：培養(yǎng)基=3∶2）菌體不易存活且難于產(chǎn)生芽孢[10]。工業(yè)發(fā)酵通常以每分鐘通入的空氣體積來(lái)衡量通氣量。在液體深層發(fā)酵過程中，攪拌速度和通氣量顯得尤為重要，攪拌速度通常為400~600 r·min-1，通氣量一般控制在 1∶0.6~1.2（發(fā)酵培養(yǎng)基體積與每分鐘通入空氣的體積之比）。通氣量過大易產(chǎn)生大量泡沫，從排氣口沖出，導(dǎo)致污染，同時(shí)也影響氧傳遞，因此在發(fā)酵液中添加消泡劑是十分必要的。在發(fā)酵的不同階段，通氣量可以適當(dāng)調(diào)節(jié)。發(fā)酵前期，菌數(shù)低，耗氧少，通氣量為1∶0.6~1.0即可；進(jìn)入對(duì)數(shù)期，耗氧增大，通氣量需提高為1∶1.0~1.2[1]。同時(shí)配合攪拌以強(qiáng)化供氧，為防止細(xì)胞受損，不宜采用剪切式攪拌。當(dāng)芽孢形成以后，雖然菌體代謝活性降低，但氧對(duì)芽孢的成熟和伴孢晶體的形成有重要影響，因此后期仍應(yīng)保持較大的通氣量，可略低于對(duì)數(shù)期通氣量[9]。

1.1.4 接種

工業(yè)生產(chǎn)過程中通常采用3級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)，即搖瓶→種子罐→發(fā)酵罐。從種子罐到發(fā)酵罐通常有 2種接種方式：芽孢接種和營(yíng)養(yǎng)體接種。芽孢接種可殺滅雜菌及噬菌體，獲得較高的同步率，但芽孢萌發(fā)慢，延遲期較長(zhǎng)。嚴(yán)格控制滅菌條件，避免污染，采用活性營(yíng)養(yǎng)體接種芽孢產(chǎn)率可能更高。Pearson和Ward[11]在研究Bt subsp. israelensis的接種條件時(shí)，選擇有抑制芽孢形成能力的培養(yǎng)基作為種子培養(yǎng)基，這種營(yíng)養(yǎng)體接種方式能有效提高同步率與細(xì)菌總數(shù)，芽孢產(chǎn)率在90%以上。Bt對(duì)培養(yǎng)基的適應(yīng)能力不同，在發(fā)酵培養(yǎng)基中馴化后再作為種子接種往往能縮短延遲期[12]。另外 Wu和 Chen[13]在研究中還發(fā)現(xiàn)接種時(shí)機(jī)能明顯影響毒素產(chǎn)量，在菌體活性最強(qiáng)時(shí)（延遲期末，對(duì)數(shù)期初）接種，Bt subsp.darmstadiensis HD-199的外毒素產(chǎn)量比指數(shù)末期接種提高了3倍。

1.2 培養(yǎng)基組分

1.2.1 碳源

Bt是一類化能有機(jī)營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌，只能利用有機(jī)含碳化合物作為碳源和能源。自然界的含碳化合物種類繁多，并非都能被 Bt利用，常用作碳源培養(yǎng)Bt的主要是糖類[1]。單糖如葡萄糖可直接被 Bt吸收，多糖需經(jīng)菌體產(chǎn)生的胞外淀粉酶水解成葡萄糖等單糖再被吸收。培養(yǎng)基中含有適量葡萄糖，可以促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，縮短發(fā)酵周期。但在工業(yè)生產(chǎn)中培養(yǎng)基滅菌時(shí)，受Fe2+、PO43-的影響，葡萄糖易焦糖化，需單獨(dú)滅菌，使操作過程變得復(fù)雜[14]；而且由于葡萄糖代謝產(chǎn)酸，大量葡萄糖會(huì)使pH值迅速下降，產(chǎn)生碳源抑制，使代謝進(jìn)程受阻[15]。因此淀粉、糊精、糖蜜和甘油等多糖都被用作 Bt發(fā)酵的常用碳源，它們可以克服葡萄糖代謝過快的弊病，保持發(fā)酵后期有一定的糖源。Yasemin Icgen等人考查了各種碳源對(duì) Bt的影響，研究發(fā)現(xiàn)蔗糖、乳糖和菊粉作碳源時(shí)毒效較高，同時(shí)也支持芽孢形成，乳清及糖蜜對(duì)毒素合成有促進(jìn)作用，而其他碳源包括葡萄糖、甘油、麥芽糖、淀粉和糊精都得到較低的毒素量[16]；Melek ?zkan等人則發(fā)現(xiàn)菊粉、糊精、麥芽糖、乳糖、蔗糖、乳清、甘油等對(duì) Bt subsp. israelensis HD500的毒效有促進(jìn)作用，而葡萄糖、淀粉和糖蜜用作碳源時(shí)毒素產(chǎn)量低[6]?？梢姴煌陮?duì)碳源種類及營(yíng)養(yǎng)需求存在差異。

1.2.2 氮源

工業(yè)上常用的氮源有黃豆粉、棉籽餅粉、花生餅粉、玉米漿等，其中玉米漿還有較強(qiáng)的緩沖能力，對(duì)Bt的生長(zhǎng)有利。Salama等人采用棉籽餅粉、魚粉、牛血等農(nóng)副產(chǎn)品以及一些當(dāng)?shù)乜傻玫牧畠r(jià)高蛋白廢渣，如飼料酵母、雞舍墊料、各類豆渣等，采用 Bt subsp. kurstaki HD-1、Bt subsp. kurstaki HD-73和Bt subsp. entomocidus等菌株進(jìn)行發(fā)酵[17]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)飼料酵母為 Bt生長(zhǎng)的最適氮源，三株菌的芽孢數(shù)都可達(dá)到1×109CFU·mL-1以上，其次為牛血；而棉籽餅粉更適合培養(yǎng)Bt subsp. kurstaki HD-73，雞舍墊料對(duì) Bt subsp. kurstaki HD-1和 Bt subsp.entomocidus生長(zhǎng)較為有利。當(dāng)制劑濃度為500μg/ml時(shí)，采用飼料酵母、牛血、雞舍墊料作為氮源的Bt subsp. kurstaki HD-73與Bt subsp. kurstaki HD-1制劑對(duì)棉鈴蟲（H. armigera）的致死率均可達(dá)80%~100%，以各種豆渣作為氮源培養(yǎng)的Bt subsp.entomocidus對(duì)棉貪夜蛾（S. littoralis）的致死率也可達(dá)90%左右?？梢姴煌陮?duì)氮源種類具有選擇性，而不同氮源又影響同一菌株對(duì)各類昆蟲的毒效。因此在每一個(gè)新菌株用于生產(chǎn)之前，都需要進(jìn)行最適培養(yǎng)基的選擇。無(wú)機(jī)氮源通常難以被利用，但新近研究表明，無(wú)機(jī)氮能增加蛋白水解活性，蛋白水解活性可進(jìn)一步影響晶體蛋白的穩(wěn)定性。Yasemin Icgen等人的研究還表明無(wú)機(jī)氮源能影響B(tài)t的蛋白組成（該菌株可合成135 kDa Cry I及65 kDa Cry II兩種有效蛋白）。當(dāng)(NH4)2SO4質(zhì)量濃度從0~2 g·L-1時(shí)，65 kDa蛋白隨之濃度增加而提高，用NH4Cl替換(NH4)2SO4則導(dǎo)致135 kDa蛋白含量降低，而改用KNO3可導(dǎo)致65 kDa蛋白消失[18]；Melek ?zkan[6]等人也發(fā)現(xiàn)(NH4)2HPO4用作無(wú)機(jī)氮源時(shí)能使Cry11Aa和Cry4Ba蛋白產(chǎn)量提高。目前對(duì)無(wú)機(jī)氮源的研究還在不斷深入。

1.2.3 碳氮比

作為微生物生長(zhǎng)最重要的營(yíng)養(yǎng)源，碳、氮源充足是微生物正常生長(zhǎng)代謝的必要條件，但同步增加碳、氮源并不能有效提高生物量與毒效，濃度過高還會(huì)產(chǎn)生底物抑制，研究發(fā)現(xiàn)碳氮比在其中起關(guān)鍵作用。首先，碳氮比會(huì)明顯影響發(fā)酵體系的 pH，高碳氮比培養(yǎng)基的pH在整個(gè)代謝過程中不會(huì)上升太高，最終停留在7.5左右；而低碳氮比時(shí)發(fā)酵終點(diǎn)的pH可上升至8.5以上[19]。通常低碳氮比培養(yǎng)基毒素產(chǎn)量略高，但毒素產(chǎn)量還不能完全理解為毒效。Mummigatti和Raghunathan 研究時(shí)就遇到了這種情況，盡管低碳氮比時(shí)芽孢數(shù)及毒素產(chǎn)量略高，但毒效較低；而 Lachhab[21]等人在研究污泥發(fā)酵培養(yǎng)Bt HD-1時(shí)也發(fā)現(xiàn)較高的碳氮比對(duì)提高毒效有利，當(dāng)碳氮比在 8~10左右時(shí)，殺蟲毒效較好。因此在選擇碳、氮源時(shí)，不可一味追求生物量與毒素產(chǎn)量，需結(jié)合生物毒效確定合理的碳氮比。

1.2.4 礦質(zhì)元素

Bt需要的礦質(zhì)養(yǎng)料可分為常量元素和微量元素兩大類。常量元素包括磷、鎂、鈉、鉀和鈣，主要參與細(xì)胞組成、能量轉(zhuǎn)移、物質(zhì)代謝以及調(diào)節(jié)細(xì)胞原生質(zhì)狀態(tài)或細(xì)胞通透性等[1]。磷是組成核酸和磷脂的成分，也是蘇云金素的重要組成部分，許多酶的活性基中都有磷的參與。常用的磷鹽主要是K2HPO4和KH2PO4，在提供磷的同時(shí)也補(bǔ)充了鉀。Melek ?zkan等人報(bào)道較高濃度的無(wú)機(jī)磷對(duì)合成Cry4Ba很有效，當(dāng)培養(yǎng)基中含50~100 m M K2HPO4時(shí)，Cry4Ba和Cry11Aa以及芽孢產(chǎn)率均顯著提高。磷酸鹽對(duì)細(xì)胞和環(huán)境中的酸堿度還起到緩沖作用[6]，常用作生測(cè)時(shí)細(xì)胞及晶體的保護(hù)劑。鎂是核糖體和膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定劑，能激活酶反應(yīng)，對(duì)重金屬引起的細(xì)胞毒害還有一定的拮抗作用。Yasemin Icgen等發(fā)現(xiàn)鎂影響135 kDa和65 kDa毒性蛋白組分的生物合成，當(dāng)Mg2+濃度在8×10-5~4×10-3M時(shí)，生長(zhǎng)、芽孢形成及晶體蛋白合成量都很高[18]。鉀的主要作用是維持滲透壓和離子平衡。Wakisaka等證實(shí)在Bt subsp. kurstaki和aizawai培養(yǎng)基中加入鉀鹽比鈉鹽有助于δ-內(nèi)毒素的形成，當(dāng)K+濃度達(dá)0.20 M時(shí)，產(chǎn)量及內(nèi)毒素活性較高[22]。鈣不參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成，而是以離子狀態(tài)控制細(xì)胞的生理狀態(tài)，如降低細(xì)胞質(zhì)膜的通透性，調(diào)節(jié)酸堿度，并對(duì)一些陽(yáng)離子的毒性有拮抗作用。與磷類似，鈣鹽也能起到緩沖作用，培養(yǎng)基中加入適量的CaCl2或CaCO3可緩和pH 變化[23]。

微量元素有錳、鋅、硅、銅和鐵，它們多為輔酶或輔基。Bt對(duì)微量元素的需要量很少，通常在水和其他養(yǎng)料成分中作為雜質(zhì)存在的含量足以滿足其需要。鐵是細(xì)胞色素、細(xì)胞色素氧化酶和過氧化氫酶的活性組成成分；鋅是乙醇脫氫酶的輔基，許多酶的活性也靠鋅激活[1]；錳也是多種酶的激活劑，濃度達(dá)到10-6M時(shí)對(duì)Cry4Ba和Cry11Aa毒素產(chǎn)量即有明顯影響[6]，Yousten’s培養(yǎng)基中含3×10-4M錳對(duì)生長(zhǎng)及毒素合成最有利。銅也有一定激活作用，加入10-7M時(shí)晶體蛋白合成明顯受到激發(fā)，增加至10-6和 10-5之間時(shí)，可導(dǎo)致晶體蛋白產(chǎn)量降低，適宜控制銅濃度可使芽孢數(shù)比不加銅時(shí)提高3倍。此外，Abrosimova等人發(fā)現(xiàn)增加礦物鹽的培養(yǎng)基有更好的耐熱性能，這可能是由于鹽組分（尤其是鉀鹽）能明顯提高細(xì)胞的護(hù)溫屏障[24]。

總之，在 Bt發(fā)酵生產(chǎn)中，這些礦質(zhì)元素的加入量一般為：KH2PO4或K2HPO4為0.075%~0.2%；MgSO4·7H2O 為 0.075%~0.3%；CaCO3為0.075%~0.15% ； MnSO4·H2O 、 FeSO4·7H2O 均 為0.002%。

1.2.5 其它

發(fā)酵過程中添加消泡劑等表面活性劑對(duì)發(fā)酵也有促進(jìn)作用，Zouari和 Jaoua[25]在培養(yǎng)基中加入了0.5% NaCl和0.1%的Tween-80，發(fā)現(xiàn)含固率<59 g·L-1時(shí)，Tween-80有助于提高δ-內(nèi)毒素產(chǎn)量，高于75 g·L-1時(shí)，Tween-80在產(chǎn)量提高方面作用不大，但仍能顯著降低蛋白水解活性?？傊?，Bt的微生物發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的物質(zhì)及能量轉(zhuǎn)化過程，影響因素較多，且各因素間往往相互影響，需綜合調(diào)配。表1列出了優(yōu)化培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件所得部分代表性成果。

表1 Bt培養(yǎng)條件與培養(yǎng)基組分的優(yōu)化Table 1 Typical achievements of optimized culture media and culture conditions on Bt fermentation

圖1 液體深層發(fā)酵基本工藝流程Fig.1 Schematic diagram showing submerged fermentation process of Bt

2 蘇云金桿菌的發(fā)酵工藝選擇

2.1 液體深層發(fā)酵：

1956年前蘇聯(lián)發(fā)表了用液體培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)Bt，并用于防治菜青蟲的報(bào)道[1]，從而揭開了Bt液體培養(yǎng)的序幕，Bt制劑之所以能廣泛應(yīng)用，關(guān)鍵在于能通過液體深層發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)。其工藝流程如圖1所示。

液體發(fā)酵主要有分批發(fā)酵、補(bǔ)料分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵三種方式[30]。分批發(fā)酵一次性投料，工藝簡(jiǎn)單，但若要達(dá)到較高的發(fā)酵水平，需要較高的基質(zhì)濃度，這種情況下很容易產(chǎn)生基質(zhì)和代謝產(chǎn)物抑制[31]，同時(shí)培養(yǎng)基的粘度增加后，由于影響混合和流動(dòng)而不利于氧的傳遞，最終可能使毒效大打折扣。為此人們從反應(yīng)器和工藝角度進(jìn)行了改進(jìn)。采用外環(huán)流氣升式反應(yīng)器，通過氣體噴射推動(dòng)液體循環(huán)流動(dòng)以取代傳統(tǒng)的機(jī)械攪拌方式[32]，由于能耗低、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、傳質(zhì)效果好、換熱面積大、剪切力低等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)Bt毒效的提高有很大幫助，但目前還缺乏大型生產(chǎn)的經(jīng)驗(yàn)，尚處于研究階段；提高攪拌速度或增大通風(fēng)量以改善供氧環(huán)境，有助于毒效的提高[33]，但勢(shì)必以增加能耗為代價(jià)。于是有人提出了流加工藝，逐漸提高基質(zhì)濃度以削弱抑制，也因此實(shí)現(xiàn)了Bt的連續(xù)發(fā)酵，但長(zhǎng)時(shí)間的連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)基很容易染菌，菌種也易發(fā)生退化或產(chǎn)生無(wú)孢突變株[34]。綜合兩者的優(yōu)點(diǎn)，補(bǔ)料分批發(fā)酵被認(rèn)為有較好的發(fā)展前景，即逐漸補(bǔ)料，一次出料。補(bǔ)料方式又可分為連續(xù)式和間歇式，Kang等研究發(fā)現(xiàn)間歇式補(bǔ)料比連續(xù)式細(xì)菌增殖快，芽孢密度大；連續(xù)式補(bǔ)料在補(bǔ)料過程中即使細(xì)胞增殖緩慢也不會(huì)像分批發(fā)酵那樣很快轉(zhuǎn)入芽孢期，補(bǔ)料濃度過高則不能形成芽孢[35]。Zhou等通過控制pH值來(lái)調(diào)節(jié)補(bǔ)料，補(bǔ)料過程中pH保持在7.0左右，避免了營(yíng)養(yǎng)過剩問題，蘇云金素產(chǎn)量比分批發(fā)酵提高了89.51%[35]。

2.2 固態(tài)發(fā)酵：

固態(tài)發(fā)酵起源于我國(guó)傳統(tǒng)的“制曲”技術(shù)，是利用顆粒載體表面所吸附的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或顆粒本身提供的營(yíng)養(yǎng)來(lái)培養(yǎng)微生物[1]。在相對(duì)小的空間內(nèi)，這些顆粒載體可提供相當(dāng)大的氣液界面，從而滿足好氣微生物增殖所需要的水份、氧氣和營(yíng)養(yǎng)。20世紀(jì)50年代，國(guó)外開始將這項(xiàng)技術(shù)用于Bt的發(fā)酵生產(chǎn)。70年代，我國(guó)許多地區(qū)與單位都進(jìn)行了Bt的固態(tài)發(fā)酵研究，直到上世紀(jì)80年代，其生產(chǎn)工藝才逐漸完善。傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵按設(shè)計(jì)規(guī)?？煞譃榫W(wǎng)盤薄層法、皿箱式、大池通風(fēng)法以及地坪式等發(fā)酵方式[1]，如圖2所示。

可用于蘇云金固態(tài)發(fā)酵的原料很廣泛，但選擇時(shí)既要考慮物料的營(yíng)養(yǎng)性，也要考慮載體的通氣性。通常使用的載體可分為有機(jī)載體和無(wú)機(jī)載體兩類，有機(jī)載體如麥麩、米糠、黃豆餅粉、花生餅粉等，既可作為營(yíng)養(yǎng)源，又兼有載體作用；無(wú)機(jī)載體如多孔珍珠巖、細(xì)沙等，這些物質(zhì)通氣性能較好，但需要另外添加營(yíng)養(yǎng)成分[31]。楊淑蘭等[36]利用麩皮、棉籽餅粉、米糠、草木灰等為發(fā)酵原料，進(jìn)行了百公斤級(jí)的Bt subsp. HD-1固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)種齡、發(fā)酵溫度、初始pH值、基質(zhì)含水量與草木灰含量等是影響芽孢形成和毒效的重要因素，選擇最佳培養(yǎng)條件可使發(fā)酵芽孢數(shù)穩(wěn)定在2.0×10 CFU·g-1，在2000倍稀釋度條件下對(duì)菜青蟲的致死率為100%?；|(zhì)的通氣性主要用含水量來(lái)控制。適宜的初始含水量，使得培養(yǎng)基有合適的疏松度，顆粒間存在一定空隙，有助于菌體從培養(yǎng)基獲得營(yíng)養(yǎng)成分和氧的傳遞，從而促進(jìn)生長(zhǎng)繁殖，而過高的含水量會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基粘結(jié)成團(tuán)，多孔性降低，影響氧的傳遞；含水量過低，則使培養(yǎng)基膨脹程度降低，水的活度低，抑制菌體生長(zhǎng)。Capalbo等人將潮濕的稻谷裝入聚丙烯袋接種Bt subsp. tolworthi進(jìn)行了固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室研究，濕度控制在50%~60%，產(chǎn)物田間毒效良好，48 h死亡率可達(dá)100%[37]。固態(tài)發(fā)酵具有低投資、低成本、低排污等優(yōu)點(diǎn)[38]，但因輸送、攪拌、溫度、濕度、pH值和供氧等諸多問題缺少工程解決手段而使其發(fā)展受到了限制。陳洪章等人首先提出了壓力脈動(dòng)固態(tài)發(fā)酵技術(shù)，利用壓力脈動(dòng)周期刺激強(qiáng)化生物反應(yīng)和細(xì)胞膜傳質(zhì)速率。壓力脈動(dòng)避免了機(jī)械攪拌的缺陷，提高了傳質(zhì)傳熱效率，降低溫度、O2和CO2濃度梯度，促進(jìn)了毒效的提高。目前，壓力脈動(dòng)固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器已成功放大到70 m3的工業(yè)級(jí)生產(chǎn)規(guī)模[39]。

在發(fā)酵過程中，液態(tài)發(fā)酵流動(dòng)性好，傳質(zhì)、傳熱性能優(yōu)于固態(tài)發(fā)酵，也便于控制；但在后處理過程中，液態(tài)發(fā)酵通常需要碳酸鈣助濾或離心濃縮，操作復(fù)雜且有效成分易流失，而固態(tài)發(fā)酵可以直接進(jìn)行干燥、粉碎，能源消耗小，但可濕潤(rùn)性較差?？梢姡に嚩即嬖诟髯缘膬?yōu)缺點(diǎn)，選用何種發(fā)酵工藝還應(yīng)依據(jù)培養(yǎng)基組分與發(fā)酵水平，以進(jìn)行綜合調(diào)控。

圖2 固態(tài)發(fā)酵基本工藝流程Fig.2 Schematic diagram solid-state fermentation process of Bt

3 展望

化學(xué)殺蟲劑的弊端引發(fā)了人們對(duì)生物殺蟲劑的關(guān)注，而 Bt的研究與應(yīng)用推動(dòng)了生物殺蟲劑的發(fā)展。據(jù)專家預(yù)測(cè)，今后10年內(nèi)，由于有機(jī)農(nóng)業(yè)、森林防治與生物殺蚊劑市場(chǎng)的需求驅(qū)動(dòng)，生物殺蟲劑產(chǎn)量將以10%~15%的速率遞增[40]，Bt生物殺蟲劑的研究還有待進(jìn)一步深入。

（1）原料價(jià)格是 Bt生物殺蟲劑規(guī)?；闹萍s因素，傳統(tǒng)發(fā)酵原料價(jià)格約占總生產(chǎn)成本的35%~59%[41]，因此應(yīng)致力于開發(fā)低成本、當(dāng)?shù)乜傻玫墓まr(nóng)業(yè)廢棄物為原料，已有學(xué)者曾嘗試以污泥[42,43]、味精廢水[44]、廢啤酒酵母浸出液[45]等為發(fā)酵原料，這不僅為生物殺蟲劑的推廣創(chuàng)造了有利條件，還充分利用了廢棄資源。目前，低成本培養(yǎng)原料選擇與優(yōu)化還處于起步階段，如何放大投產(chǎn)是亟待解決的問題。

（2）傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝已不能滿足日益增長(zhǎng)的應(yīng)用需求，高效生產(chǎn)工藝的開發(fā)十分迫切。已有研究表明，以提高毒蛋白為目的的高密度補(bǔ)料發(fā)酵工藝和壓力脈動(dòng)固態(tài)發(fā)酵工藝將有廣闊的應(yīng)用前景。

（3）為了進(jìn)一步提高 Bt的殺蟲效果，如延長(zhǎng)持效期、擴(kuò)大殺蟲譜等，可以通過對(duì)殺蟲基因的修飾、改造、轉(zhuǎn)移等基因工程手段構(gòu)建新型的工程菌[46]。在國(guó)外，已有Conder、MVP等10余種Bt工程菌制劑投人了商業(yè)應(yīng)用[47]。在我國(guó)，Bt工程菌劑的研發(fā)也有擴(kuò)大趨勢(shì)，如高效 Bt和熒光假單胞菌的組合基因工程菌劑WG001已于2000年通過安全性審批，更多新型Bt工程菌劑正有待開發(fā)與應(yīng)用。

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