酪酸菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化

李賢宇，張蕊，周博

（天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300402）

酪酸菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化

李賢宇，張蕊，周博

（天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300402）

酪酸菌為人和動物腸道內(nèi)正常菌群中的一種有益菌，能產(chǎn)生各種維生素，對人體具有保健作用，酪酸菌的芽孢是一種較理想有開發(fā)前景的微生態(tài)制劑。制備酪酸菌微生態(tài)制劑首先要實現(xiàn)酪酸菌的高密度培養(yǎng)，其次是獲得較高酪酸菌芽孢轉(zhuǎn)化率，本文對酪酸菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，取得良好的效果。

酪酸菌；培養(yǎng)條件；優(yōu)化

酪酸梭狀芽孢桿菌（酪酸菌），又稱丁酸菌，是1933年由日本千葉醫(yī)科大學(xué)宮入近治博士首先發(fā)現(xiàn)并報告的[1]。該菌在于土壤、酸奶、動物和人體的腸道等厭氧環(huán)境中，菌體為直或微彎曲，大小為0．6～1．2×3．0～7．0 μ，端圓，周生鞭毛，能運動。菌體中常有圓形或橢圓形芽孢，菌體中部膨大呈梭形，芽孢偏心或次端生、無芽孢外壁或附屬絲。

酪酸菌為人和動物腸道內(nèi)正常菌群中的一種有益菌[2，3]，能夠大量補充腸道內(nèi)正常菌群的數(shù)量，促進(jìn)其它有益菌群的增殖；能產(chǎn)生B族維生素、維生素K、丁酸等物質(zhì)，對人體具有保健作用。并能在腸粘膜表面形成微生物屏障，阻止有害菌的定植和入侵，有效地改善腸道內(nèi)微生態(tài)環(huán)境，是一種較理想的有開發(fā)前景的微生態(tài)制劑。制備酪酸菌微生態(tài)制劑首先要實現(xiàn)酪酸菌的高密度培養(yǎng)，其次是獲得較高酪酸菌芽孢轉(zhuǎn)化率，因此，使酪酸菌的培養(yǎng)濃度和芽孢轉(zhuǎn)化率均獲得較大幅度的提高。已成為研究和開發(fā)酪酸菌微生態(tài)制劑的關(guān)鍵。本文就此實驗對酪酸菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和儀器

菌種：酪酸菌，天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院微生物實驗室分離保藏菌種。

主要儀器：高速離心機（北京醫(yī)用離心機廠），磁力攪拌器，氮氣鋼瓶。

1.2 實驗方法

1.2.1 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基

胰蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏3 g，葡萄糖5 g，氯化鈉5 g，可溶性淀粉1 g，L-半光氨酸鹽0．5 g，乙酸鈉3 g，溶于1000 mL水中，調(diào)pH7．5。

1.2.2 菌體濃度的測定

采用活菌計數(shù)法，取1 mL發(fā)酵液加入到9 mL滅菌的生理鹽水中，依次做10倍梯度稀釋，選取三個適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)，吸取1 mL稀釋液注入無菌培養(yǎng)皿中，傾注法加入15 mL培養(yǎng)基混勻，每個稀釋度做三個平行培養(yǎng)皿。待培養(yǎng)基凝固后，倒置放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h。選取菌落在30～300之間的培養(yǎng)皿計菌落數(shù)。

1.2.3 芽孢濃度的測定

取菌液5 mL，于80℃水浴加熱10 min，殺死營養(yǎng)體細(xì)胞，然后采用上述活菌計數(shù)法計數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 酪酸菌接種量對菌體濃度的影響

接種量大小對培養(yǎng)結(jié)果有一定影響，接種量過大會帶入較多的種子培養(yǎng)期的代謝產(chǎn)物，并使菌體前期生長過快，從而會造成培養(yǎng)后期的代謝副產(chǎn)物大量累積，使最終菌濃有所降低；接種量過小則使菌體增殖緩慢，培養(yǎng)時間延長。

實驗分別采用了2%、5%、10%和15%四個接種量進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)20 h后結(jié)果見圖1。由圖1可知，在培養(yǎng)20 h之后，15%接種量組已進(jìn)入穩(wěn)定期，但菌體濃度并不是最高；2%和5%接種量組仍處于指數(shù)期，生長過慢；而10%的接種量可使菌濃達(dá)到較高水平。

圖1 接種量對菌濃的影響

2.2 培養(yǎng)溫度對菌體濃度及芽孢轉(zhuǎn)化率的影響

選不同的培養(yǎng)溫度進(jìn)行實驗比較，菌體的生長情況和芽孢轉(zhuǎn)化率如圖2所示。從圖2可知，酪酸菌生長的最適溫度為37℃，較高或者較低的溫度對酪酸梭狀芽孢桿菌的生長影響較大；但當(dāng)溫度低于或者高于37℃時，菌體的芽孢轉(zhuǎn)化率卻有所增加。

圖2 培養(yǎng)溫度對酪酸菌生長及芽孢轉(zhuǎn)化率的影響

為了在不降低菌體濃度的情況下提高芽孢轉(zhuǎn)化率，實驗采用了兩步培養(yǎng)法。首先在37℃培養(yǎng)，待菌體到達(dá)穩(wěn)定期后，適當(dāng)?shù)慕档突蛘咛岣吲囵B(yǎng)溫度，芽孢的轉(zhuǎn)化率如表1所示。從表1可以看出，當(dāng)酪酸菌培養(yǎng)至穩(wěn)定期（20 h）后，溫度降至30℃繼續(xù)培養(yǎng)至32 h時，所得到的芽孢生成率可達(dá)95%；升高溫度也有利于芽孢的形成，但當(dāng)溫度高于40℃時，菌體死亡很快，最終雖然獲得的芽孢生成率較高，但由于菌體數(shù)目的大幅度減少，芽孢的總體收率降低。

表1 20 h后改變培養(yǎng)溫度對芽孢轉(zhuǎn)化率的影響

2.3 氮氣保護(hù)實驗

對于專性厭氧菌——酪酸梭狀桿菌來說，對其生長造成強烈影響的是進(jìn)入三角瓶中的空氣以及該部分氣體和發(fā)酵液的混合程度。由于實驗過程中間斷性地進(jìn)行取樣，帶入空氣不可避免，為了消除這兩個方面的影響，實驗采用了氮氣保護(hù)和發(fā)酵栓同時使用的方法，實驗裝置如圖3所示。

圖3 氮氣保護(hù)實驗裝置

以10%接種量接種后，安裝好發(fā)酵栓，打開進(jìn)氣閥門通入氮氣，將滯留在三角瓶內(nèi)的空氣趕出，然后關(guān)閉進(jìn)氣閥（每次中間取樣結(jié)束后重復(fù)此步操作）。將培養(yǎng)裝置放入?yún)捬跸?，并開啟磁力攪拌器輕微攪拌，分別測定兩種情況下的菌體濃度：（1）每隔2 h取樣一次，培養(yǎng)20 h后測定菌體濃度；（2）培養(yǎng)過程中不取樣，培養(yǎng)20 h后測定菌體濃度。并與靜置培養(yǎng)比較，如圖4所示。

圖4 兩種培養(yǎng)方式下菌體濃度比較

從圖4中可以看出，靜置培養(yǎng)時，酪酸菌的菌濃要比采用發(fā)酵拴進(jìn)行氮氣保護(hù)培養(yǎng)時低得多，其主要原因是由于后者使用了磁力攪拌，使培養(yǎng)液與菌體均勻混合，促進(jìn)了菌體與培養(yǎng)液之間的物質(zhì)交換。如果每2 h取樣一次，靜置培養(yǎng)由于受進(jìn)入三角瓶內(nèi)空氣的影響，菌濃下降幅度較大；而對于氮氣保護(hù)實驗而言，整個培養(yǎng)過程中取不取樣對菌濃的影響不大。由此可見，氮氣保護(hù)實驗很好的消除了由于間斷取樣造成的氧對酪酸菌生長的危害。

2.4 培養(yǎng)時間的確定

將菌種接種于上述培養(yǎng)基中，依照上述培養(yǎng)條件，采用發(fā)酵栓進(jìn)行氮氣保護(hù)培養(yǎng)實驗，每隔2 h對培養(yǎng)期間的菌濃、pH值和芽孢轉(zhuǎn)化率進(jìn)行取樣測定，結(jié)果如圖5所示。從圖5可看出菌體的最高濃度出現(xiàn)在20 h；芽孢的最大轉(zhuǎn)化率出現(xiàn)在36 h，但此時由于菌體的濃度下降幅度較大，并不是芽孢的最佳收獲時期，綜合考慮，芽孢的最佳收獲時期應(yīng)在30～32 h之間。

圖5 酪酸菌的生長曲線圖

3 結(jié)論

3.1 單因子實驗表明，酪酸菌的最佳接種量為10%。

3.2 酪酸菌生長的最適溫度為37℃；但待菌體到達(dá)穩(wěn)定期后，適當(dāng)?shù)慕档团囵B(yǎng)溫度卻有利于芽孢的形成。當(dāng)酪酸菌培養(yǎng)至穩(wěn)定期（20h）后，溫度降至30℃繼續(xù)培養(yǎng)至32h時，所得到的芽孢生成率可達(dá)95%。

3.3 對于專性厭氧菌——酪酸梭狀桿菌來說，對其生長造成強烈影響的是進(jìn)入三角瓶中的空氣以及該部分氣體和發(fā)酵液的混合程度。由于實驗過程中間斷性地進(jìn)行取樣，帶入空氣不可避免。實驗采用氮氣保護(hù)和發(fā)酵栓同時使用的方法，很好地消除了由于間斷取樣造成的氧對酪酸菌生長的影響。

3.4 酪酸菌的生長曲線表明，細(xì)胞的最佳收獲時間為20 h、芽孢的最佳收獲時間為30～32 h之間。

［1］ 莊志發(fā)，馮紫慧.簡述微生態(tài)活菌（酪酸菌）制劑的研究應(yīng)用[J].山東食品發(fā)酵，1999，（1）：32～35.

［2］ John Marinko,Michael Madigan.Brock Biology of microorganisms [M].Prentice Hall,2005.

［3］ 宋會儀，吳天星.酪酸菌微生態(tài)制劑的生物學(xué)功能及在飼料中的應(yīng)用[J].飼料工業(yè)，2006，27（12）：10～11.

Optimization of clostridiun butyricum culture condition

LI Xian-yu,ZHANG Rui,ZHOU Bo
(Tianjin Bohai Vocatinal Technical College,Tianjin 300402)

As a beneficial bacteria,clostridium butyricum can produce a variety of vitamins,and has a health care on the human body．The spores of Clostridium butyricum are ideal microecological agents which have development prospects．Clostridium butyricum high-density culture must be carried out first before the preparation of microecological agents,followed by a higher conversion rate of butyric acid bacteria spores．Clostridium butyricum culture conditions were optimized in this paper and achieved good results．

clostridium butyricum;culture conditions;optimization

book=3,ebook=22

10．3969/j．issn．1008-1267．2010．01．008

Q839.1

A

1008-1267（2010）01-0022-03

2009-10-12