重組人血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合放療對(duì)小鼠腎癌移植瘤的協(xié)同抗瘤效應(yīng)研究

白晉陽 邢月明 吳偉

腎癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，占所有成人惡性腫瘤的2%～3%。世界范圍內(nèi)，腎癌的死亡病例每年超過100000例［1］。既往臨床發(fā)現(xiàn)約有20% ～30%的患者確診時(shí)己有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，治療效果和預(yù)后不甚理想。本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性的利用重組人血管內(nèi)皮抑素(恩度)聯(lián)合放療治療小鼠腎癌移植瘤，觀察兩者對(duì)小鼠腎癌是否有協(xié)同抗瘤效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設(shè)備 48只6周齡BALB/c雌性小鼠及renca腎癌細(xì)胞株由中科院腫瘤醫(yī)院提供;恩度由先聲藥業(yè)公司惠贈(zèng);免疫組化試劑盒購于北京博奧深生物技術(shù)有限公司;山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院腫瘤科提供Co60放射治療機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法及相應(yīng)處理

1.2.1 動(dòng)物模型的建立與分組 取傳代14 d的renca腎癌荷瘤小鼠2只，處死后剝離腫瘤制成細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為1.0×107個(gè)/ml。在每只小鼠右后肢外側(cè)皮下注射細(xì)胞懸液0.2 ml。各組均正常喂養(yǎng)，待小鼠皮下種植瘤體積達(dá)0.4 cm3左右時(shí)，將48只荷瘤小鼠隨機(jī)分組:①對(duì)照組，生理鹽水腹腔注射，自放療開始日連用14 d;②恩度組，恩度按10 mg/(kg·d)腹腔注射，自放療開始連用14 d;③放療組，清醒狀態(tài)下固定，對(duì)每只小鼠右后肢腫瘤局部照射，放療劑量為5 gy/次，隔日進(jìn)行，共4次;④恩度+放療組，恩度和放療方法劑量同上。

1.2.2 移植瘤的療效觀察 觀察荷瘤鼠一般情況。每隔一天專人用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的最大長(zhǎng)徑(A)和與之垂直的最大寬徑(B)，體積(V)=1/6AB2π(A大于B)計(jì)算各組小鼠腫瘤平均體積，比較各組小鼠腫瘤的生長(zhǎng)情況并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。

1.2.3 移植瘤病理形態(tài)觀察 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后7 d處死小鼠，取腫瘤組織，常規(guī)HE染色，觀察腫瘤組織情況。用兔抗鼠VEGF作為一抗，按照試劑盒說明書進(jìn)行SABC法免疫組織化學(xué)染色。VEGF表達(dá)陽性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)經(jīng)處理后可被標(biāo)記為棕黃色，隨機(jī)選取5個(gè)腫瘤外周區(qū)域，計(jì)數(shù)高倍鏡(×400)下染色陽性的腫瘤細(xì)胞并取均值，計(jì)算其與同一視野下腫瘤細(xì)胞總數(shù)均值的比例作為腫瘤細(xì)胞VEGF表達(dá)陽性率(%)。CD34代替VEGF抗體作為Ⅰ抗，陰性對(duì)照用PBS代替。MVD計(jì)數(shù)按Weidner［2］的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多個(gè)樣本間均數(shù)比較采用方差分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用Excel 2003軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般狀況 放療+恩度組較其余各組小鼠反應(yīng)靈敏，活動(dòng)多，毛色光亮;對(duì)照組小鼠反應(yīng)最遲鈍，活動(dòng)較少，常抱成團(tuán)。

2.2 各組小鼠移植瘤體積增長(zhǎng)曲線 隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，各組小鼠移植腫瘤的體積越來越大，對(duì)照組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)速度最快，余各組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)速度逐漸減緩，明顯受到抑制，以放療+恩度組對(duì)體積抑制作用最強(qiáng) (圖1)。

圖1 各組小鼠移植癌體積增長(zhǎng)比較

2.3 常規(guī)HE染色 光鏡下觀察瘤組織的形態(tài)學(xué)變化，對(duì)照組癌細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，核濃染，癌細(xì)胞幾乎不見壞死。放療+恩度組癌組織存在大量異型細(xì)胞，這些細(xì)胞呈片狀分布，細(xì)胞核染色較輕、固縮、壞死，壞死的腫瘤細(xì)胞較其他組均明顯增多，可見較廣泛的大片狀壞死。

2.4 腫瘤細(xì)胞VEGF表達(dá)陽性率 免疫組化結(jié)果顯示VEGF主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，陽性染色表現(xiàn)為胞漿內(nèi)均勻棕黃色細(xì)顆粒狀染色。放療+恩度組的腫瘤細(xì)胞VEGF表達(dá)陽性率最低，其余各組腫瘤細(xì)胞VEGF表達(dá)陽性率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(表2)。

表2 放療和恩度四種組合的VEGF表達(dá)均值和標(biāo)準(zhǔn)差(± s，%)

表2 放療和恩度四種組合的VEGF表達(dá)均值和標(biāo)準(zhǔn)差(± s，%)

放療 恩度不使用 使用不使用32.28±2.25 22.81±3.07使用49.64±2.31 8.17±1.05

表3 放療和恩度四種組合的MVD值均值和標(biāo)準(zhǔn)差(±s，個(gè)/200P)

表3 放療和恩度四種組合的MVD值均值和標(biāo)準(zhǔn)差(±s，個(gè)/200P)

放療 恩度不使用 使用不使用36.68±3.06 6.01±1.86 24.35±1.28 16.33±1.52使用

2.5 組織微血管密度 腫瘤組織切片中，微血管密集區(qū)多位于腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)的前緣部位。CD34顯色主要位于細(xì)胞的胞漿、核膜上，為棕黃色或褐色顆粒。放療+恩度組的腫瘤內(nèi)微血管密度(MVD值)最低，各組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(表3)。

3 討論

目前認(rèn)為腎癌放療效果差的原因除了細(xì)胞遺傳特異性外，實(shí)體瘤內(nèi)普遍含有的對(duì)放射線抗拒的乏氧細(xì)胞也起很重要的作用。研究表明乏氧細(xì)胞的放射敏感性只有含氧細(xì)胞的1/3，對(duì)放射線的耐受性比有氧細(xì)胞強(qiáng)。有研究［3-4］表明抗血管生成類藥物與放療聯(lián)用，一方面，可以協(xié)同放療致敏血管內(nèi)皮細(xì)胞，殺傷腫瘤內(nèi)部血管，并阻止放療后由于生長(zhǎng)因子表達(dá)的增加所致血管再生，從而減少腫瘤血供，促進(jìn)其壞死;另一方面，由于放療殺傷細(xì)胞依賴于氧自由基，其療效和腫瘤內(nèi)部氧分壓成正相關(guān)，而抗血管生成類藥物可導(dǎo)致腫瘤異常血管正?；?，促進(jìn)新生血管的內(nèi)皮管腔的穩(wěn)定和成熟，提高腫瘤內(nèi)部氧分壓，從而增強(qiáng)放療對(duì)癌細(xì)胞的殺傷作用。恩度是由我國(guó)學(xué)者羅永章等自主研發(fā)的一種可溶性新型重組人血管內(nèi)皮抑素，具有廣譜抗血管生成活性。本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性的應(yīng)用恩度聯(lián)合放療，與單藥恩度、單純放療對(duì)小鼠Renca腎癌療效對(duì)比。通過觀察小鼠一般狀況和腫瘤生長(zhǎng)曲線可以看出放療和恩度均抑制了腫瘤的生長(zhǎng)，但它們的作用機(jī)理不同。兩者聯(lián)合組腫瘤體積明顯縮小，說明兩者通過不同的途徑抑制腫瘤的效應(yīng)可以疊加。免疫組化SABC法檢測(cè)結(jié)果顯示單純放療組腫瘤細(xì)胞VEGF(32.28±2.25)及微血管密度MVD(24.35±1.28)表達(dá)最高，說明放療后確實(shí)能導(dǎo)致腫瘤新生血管增加從而對(duì)進(jìn)一步的放療產(chǎn)生耐受。而放療聯(lián)合恩度組無論腫瘤細(xì)胞VEGF陽性率(8.17±1.05)還是腫瘤微血管密度(6.01±1.86)與各組相比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且與單純放療組相比明顯減少，充分說明了恩度聯(lián)合放療通過減少了小鼠Renca腎癌新生血管的生成，而起到了協(xié)同抗瘤效應(yīng)。但本實(shí)驗(yàn)為鼠源性腫瘤，且樣本例數(shù)較少，要想今后應(yīng)用在人類腎癌尚需要進(jìn)一步的研究。

［1］Patel PH，Chaganti RS，Motzer RJ.Targeted therapy for metastatic renal cell carcinoma.Br J Cancer，2006，94:614-619.

［2］Weidner N，F(xiàn)olkman J，Pozza F，et al.Tumor angiogenesis is a new significant and independent prognostic indicator in early stage breast carcinoma.Natl Cancer Inst，1992，84(24):1875-1887.

［3］羅威，劉景晶.抗血管生成類藥物與放療協(xié)同作用的臨床前研究現(xiàn)狀 .藥學(xué)進(jìn)展，2008，32(11):488-493.

［4］Ergun S，Kilic N，Wurmbach J H，et al.Endostatin inhibit sangi genesis by stabilization of newly formed endothelial tubes.Angiogenesis，2001，4(3):193-206.