解脂耶氏酵母URA3基因的敲除

馮春利, 任清, 張蕾蕾, 李秀婷, 宋煥祿

(北京工商大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,北京 100048)

解脂耶氏酵母URA3基因的敲除

馮春利, 任清, 張蕾蕾, 李秀婷, 宋煥祿＊

(北京工商大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,北京 100048)

構(gòu)建了營(yíng)養(yǎng)缺陷型解脂耶氏酵母菌株,使之用于遺傳標(biāo)記和高產(chǎn)香味物質(zhì)γ-癸內(nèi)酯。作者利用基因同源重組的方法敲除掉尿嘧啶合成酶關(guān)鍵基因URA3基因,用尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基(SD-URA)添加一定濃度的5-氟乳清酸(5-FOA)和尿嘧啶篩選獲得轉(zhuǎn)化子。實(shí)驗(yàn)表明:尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株在含有5-FOA和尿嘧啶的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而野生型菌株不生長(zhǎng),從而建立了一種快速獲得營(yíng)養(yǎng)缺陷型解脂耶氏菌株的方法。

解脂耶氏酵母菌;URA3;基因敲除

解脂耶氏酵母于1942年首次被分離得到,先后被命名為Candida lipolytica、Endomycopsis lipolytica、S accharomycopsis lipolytica,最終定名為Yarrowia lipolytica(解脂耶氏酵母)[1]。解脂耶氏酵母是非常規(guī)酵母中的一種[2],非常適應(yīng)疏水環(huán)境,可以代謝不飽和羥基酸,用于香味物質(zhì)γ-癸內(nèi)酯的制備。在眾多的可以生產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯的菌株中,酵母Yarrowia lipolytica的發(fā)酵能力是較強(qiáng)的[3]。

在Yarrowia lipolytica中,URA3[4-5]基因能夠編碼乳清苷酸脫羧酶基因,該酶是尿嘧啶合成的關(guān)鍵酶。該酶又可催化5-氟乳清酸(5-FOA)[6]轉(zhuǎn)化為有毒物質(zhì)。作者通過對(duì)URA3基因敲除,使5-氟乳清酸(5-FOA)無法形成有毒物質(zhì)5-氟尿嘧啶核苷酸,從而對(duì)5-FOA具有抗性,其嘧啶核苷酸營(yíng)養(yǎng)則可以向培養(yǎng)基加入尿嘧啶通過補(bǔ)救途徑給與補(bǔ)充;而5-FOA可以抑制野生型解酯酵母菌生長(zhǎng)。因此5-FOA可用于尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體的篩選[7-8]。

作者構(gòu)建的營(yíng)養(yǎng)缺陷型解脂酵母菌株,一方面可以作為遺傳標(biāo)記,應(yīng)用于遺傳工程和菌種改良。另一方面由于解酯酵母菌一般用于香味物質(zhì)γ-癸內(nèi)酯的制備。蘇暢等[9]曾對(duì)7株菌產(chǎn)生γ-癸內(nèi)酯的能力進(jìn)行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Yarrowia lipolyticaAS2.1405產(chǎn)生γ-癸內(nèi)酯的能力最強(qiáng),產(chǎn)率為1%。作者所在實(shí)驗(yàn)室所用的菌株為Yarrowia lipolyticaAS2.1405。在不含有尿嘧啶的培養(yǎng)基中,尿嘧啶缺陷型的Yarrowia lipolytica菌株進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化蓖麻油酸甲酯,使蓖麻油酸的一個(gè)旁路代謝途徑和細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制,從而轉(zhuǎn)回內(nèi)酯的合成途徑[10],由此可以提高香味物質(zhì)γ-癸內(nèi)酯產(chǎn)量,具有非常重要的理論價(jià)值和應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 菌種及質(zhì)粒

解脂耶氏酵母Y.lipolyticaAs 2.1405:購自中國模式菌種保藏中心,是一株模式菌株,為非常規(guī)酵母,用于香味物質(zhì)γ-癸內(nèi)酯的制備;大腸桿菌DH5α:作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏;質(zhì)粒pBluscriptks +:作者所在試驗(yàn)室保藏,用于在大腸桿菌中載體制備,具有氨芐青霉素抗性,可用于大腸桿菌的藍(lán)白篩選。

1.2 培養(yǎng)基

YEPD液體培養(yǎng)基(組分g/L):葡萄糖1,蛋白胨1,酵母浸膏0.5;p H值自然。112℃滅菌20 min。

LB液體培養(yǎng)基(組分g/L):蛋白胨1,酵母浸膏0.5,NaCl 1。121℃滅菌20 min。

LB固體培養(yǎng)基:LB液體培養(yǎng)基中加1.5 g/dL的瓊脂。

GENMED酵母菌尿嘧啶合成缺陷型(SDURA)培養(yǎng)基:含有除尿嘧啶外所有其它氨基酸和核苷酸基本營(yíng)養(yǎng)元素,用于尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型的篩選,購自上海百事生物科技有限公司。

1.3 酶及主要試劑

蝸牛酶、Taq DNA Polymerase聚合酶、T4 DNA Ligase連接酶等:均購于北京天根生化科技有限公司。Trans DNA MarkerⅢ:購于北京全式金生物技術(shù)有限公司;限制性內(nèi)切酶:SalⅠ、EcoRⅠ、PstⅠ、HindⅢ等酶:購于寶生物工程(大連)有限公司;小牛胸腺DNA,5-FOA,PCR擴(kuò)增所用引物等:均購自上海生工有限公司;其他化學(xué)試劑:購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司。

1.4 引物設(shè)計(jì)

利用NCBI的Entrez檢索系統(tǒng),查知該酵母菌已經(jīng)注冊(cè)過的URA3的基因,獲得啟動(dòng)子和終止子序列;根據(jù)已知序列,用Primer premier5.0軟件設(shè)計(jì)上游引物和下游引物。

URA3上游引物:5’-CAA GGTACCGCTATCACATCACGCTCTCA-3’,下劃線部分為KpnⅠ酶切位點(diǎn)。

URA3下游引物:5’-ATCGAATTCTCATGA TTTCAAACACG-3’,下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。

1.5 主要儀器及設(shè)備

Alpha自動(dòng)凝膠成像儀:Alpha Inotech公司制造;DYY-6C電泳儀:北京六一儀器廠制造;XP梯度PCR儀:杭州博日科技有限公司制造。

1.6 方法

1.6.1 酵母基因組的提取 將保存在斜面培養(yǎng)基上的解脂酵母菌接種于2 mL液體YEPD培養(yǎng)基中,28℃振蕩過夜(200 r/min),提取酵母基因組[11],0.8 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6.2 目的基因的PCR擴(kuò)增 利用PCR方法擴(kuò)增Yarrowia lipolytica尿嘧啶合成酶關(guān)鍵基因URA3。

PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性4 s,55℃退火45 s,72℃延伸2 min 45 s,循環(huán)30次;72℃最后延伸10 min,4℃保存。

1.6.3 基因敲除組件的構(gòu)建

1)質(zhì)粒pBluscript ks+和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物URA3基因的酶切:PCR產(chǎn)物酶切體系20μL為10 ×M Buffer 2μL、PCR產(chǎn)物10μL、去離子水6.6 μL、EcoRⅠ0.7μL、KpnⅠ0.7μL;質(zhì)粒pBluscript ks+酶切體系20μL為10×M Buffer 2μL、質(zhì)粒DNA 2μL、去離子水14.4μL、EcoRⅠ0.8 μL、KpnⅠ0.8μL;37℃保溫5 h,然后電泳。將質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物酶切體系用天根瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收,然后放入-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2)重組質(zhì)粒m13-URA3的酶連:在1.5 mL離心管中加入以下20μL體系。目的DNA片段12 μL、載體DNA 3μL、10×Ligase Buffer 2μL、T4 DNA Ligase 2μL、去離子水1μL。調(diào)節(jié)保溫杯為16℃,連接過夜。

3)重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化:將酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞,方法見文獻(xiàn)[11,12]。

4)重組質(zhì)?？焖偬崛?用無菌牙簽挑菌法挑取含有氨芐青霉素LB平板上的白色菌落,接種于含Amp 50μg/mL的2 mL LB培養(yǎng)基中,37℃振蕩過夜。取出大腸桿菌至1.5 mL離心管中,離心加25μL TE緩沖液再加入25μL Tris飽和酚-氯仿(體積比1∶1),激烈振蕩混勻后12 000 r/min離心5 min,用1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

5)重組質(zhì)粒的大量提取與鑒定:提取小量快速提取后比原始質(zhì)粒大的重組質(zhì)粒,并進(jìn)行單酶切和雙酶切驗(yàn)證。

6)URA3基因敲除組件的構(gòu)建:將已經(jīng)構(gòu)建的重組質(zhì)粒m13-URA3進(jìn)行SalⅠ單酶切,由于在URA3基因的CDS區(qū)兩側(cè)有相同的SalⅠ酶切位點(diǎn),可以將URA3基因的CDS區(qū)切除,從而進(jìn)一步16℃連接過夜。轉(zhuǎn)化大腸桿菌后大量提取已經(jīng)去掉URA3的CDS區(qū)的基因敲除質(zhì)粒。

1.6.4 將URA3基因敲除組件轉(zhuǎn)化酵母 制備酵母菌感受態(tài)細(xì)胞,利用醋酸鋰方法[13-14]介導(dǎo)URA3基因敲除組件轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)化后的酵母菌涂布于含有5-FOA的GENMED酵母菌尿嘧啶合成缺陷型(SD-URA)培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)3～4 d使轉(zhuǎn)化子形成單菌落。同時(shí)做一組未進(jìn)行轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的酵母菌對(duì)照。

1.6.5 尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的篩選和分子生物學(xué)鑒定 從合成缺陷型(SD-URA)培養(yǎng)基上挑取單菌落進(jìn)行饑餓培養(yǎng)至菌體濃度不再增長(zhǎng),將其均勻涂布于加有尿嘧啶的完全培養(yǎng)基和不添加尿嘧啶的基本培養(yǎng)基上做對(duì)比。經(jīng)多次復(fù)篩和分離純化獲得遺傳性狀穩(wěn)定的尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株進(jìn)行保存。并將這些菌株進(jìn)行提取基因組后,利用原URA3基因上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

2 結(jié)果與討論

2

.1 目的基因的PCR擴(kuò)增

利用設(shè)計(jì)好的引物1和引物2,對(duì)已經(jīng)提取的酵母基因組進(jìn)行URA3基因的PCR擴(kuò)增,并獲得與NCBI上已經(jīng)公布的該基因大小相符,經(jīng)天根生物技術(shù)公司基因測(cè)序,為所需要的目的基因,長(zhǎng)度為2.56 kb,見圖1。

圖1 URA3基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCRamplification ofURA3 gene

2.2 構(gòu)建URA3基因敲除組件

首先將大小為2.56 kb左右的URA3基因連到pBluscript ks+載體上,見圖2。由于在URA3基因上有兩個(gè)SalI酶切位點(diǎn),將5.5 kb的m13-URA3重組質(zhì)粒進(jìn)行Sal I酶切,可以將URA3的CDS區(qū)切除,凝膠回收3.8 kbp左右片段,然后酶連獲得去除CDS區(qū)的重組敲除載體。其片段大小為3.8 kb左右。構(gòu)建的質(zhì)粒酶切驗(yàn)證見圖3。左側(cè)為pBluscript ks+載體和URA3基因連接后的酶切圖。1道為m13-URA3重組質(zhì)粒載體,2道為用SalⅠ酶切后將URA3基因的CDS區(qū)切除,大小分別為3.8 kb和1.7 kb。將3.8 kb片段凝膠回收,然后用T4連接酶于16℃連接構(gòu)成敲除組件。

圖2 URA3基因敲除組件的構(gòu)建過程Fig.2 Construction ofURA3 gene disrupt cassette

圖3 重組質(zhì)粒m13-URA3質(zhì)粒的單雙酶切驗(yàn)證Fig.3 Recombinantm13-URA3 plasmid digestion validation

2.3 利用基因敲除組件轉(zhuǎn)化酵母

將獲得的基因敲除組件用PstⅠ進(jìn)行單酶切,將URA3基因敲除組件切成線型,轉(zhuǎn)化酵母。此敲除組件與酵母體內(nèi)URA3基因左側(cè)有454 bp,右側(cè)有395 bp的同源片段,因此可以發(fā)生同源重組。從而替換掉酵母內(nèi)部的URA3基因,用含有一定濃度5-FOA和尿嘧啶的篩選培養(yǎng)基篩選敲除掉URA3基因的營(yíng)養(yǎng)缺陷型轉(zhuǎn)化子。表1、2為進(jìn)行初步篩選。

表1 敲除組生長(zhǎng)情況Tab.1 G rowth of the disrupted strain

表2 野生型(未敲除組)生長(zhǎng)情況Tab.2 G rowth of the wild type strain

將初篩獲得的轉(zhuǎn)化子挑取菌株接入不含尿嘧啶的液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基上,均未生長(zhǎng),同時(shí)做了對(duì)照組含有尿嘧啶和5-FOA為1 mg/mL的培養(yǎng)基,結(jié)果轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng),說明初篩獲得的營(yíng)養(yǎng)缺陷型轉(zhuǎn)化子是正確的。

2.4 尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的進(jìn)一步驗(yàn)證和分子生物學(xué)鑒定

提取營(yíng)養(yǎng)缺陷型酵母基因組和野生型酵母基因組,用URA3基因上下游引物對(duì)其分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并且在含有尿嘧啶20μg/mL和5-FOA為1 mg/mL的(SD-URA)固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。

由圖4可知,營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株進(jìn)行URA3基因PCR擴(kuò)增得到849 bp片段,而野生型菌株P(guān)CR擴(kuò)增片段仍為2 560 bp。圖5左側(cè)為野生型菌株,未生長(zhǎng),而右側(cè)為獲得的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。由此雙重驗(yàn)證了基因敲除成功,構(gòu)建出了尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。

圖4 基因缺陷型的分子生物學(xué)驗(yàn)證Fig.4 G enetic defects in molecular biology-based authentication

圖5 尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的鑒定Fig.5 Identification of uracil auxotrophic strain

3 結(jié) 語

構(gòu)建了2個(gè)重組質(zhì)粒并且均經(jīng)過了單雙酶切的驗(yàn)證,然后通過同源重組的方法轉(zhuǎn)化酵母獲得營(yíng)養(yǎng)缺陷型轉(zhuǎn)化子。在敲除掉URA3基因后,可用其作為篩選標(biāo)記,進(jìn)行其他功能基因的敲除研究。通過基因敲除技術(shù)得到的尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株,在不含有尿嘧啶的發(fā)酵培養(yǎng)基中,能夠抑制蓖麻油酸的一個(gè)旁路代謝途徑和細(xì)胞生長(zhǎng),使其轉(zhuǎn)回內(nèi)酯的合成途徑,從而提高香味物質(zhì)γ-癸內(nèi)酯產(chǎn)量,因此在下一步生產(chǎn)實(shí)踐中,還可以進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化,進(jìn)而使γ-癸內(nèi)酯產(chǎn)量更加提高,進(jìn)行香味物質(zhì)制備。

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(責(zé)任編輯:李春麗)

The Disruption ofURA3 Gene ofYarrowia lipolytica

FEN G Chun-li, REN Qing, ZHANG Lei-lei, LI Xiu-ting, SONG Huan-lu＊
(College of Chemical&Environmental Engineering,Beijing Technology&Business University,Beijing 100048,China)

In order to get high-yieldγ-decalactone and genetic markers,an auxotrophicYarrowia lipolyticastrain was isolated by genetic modification.In this study,URA3,a key gene for uracil synthetase ofYarrowialipolytica,was disrupted using the method ofgene homologous recombination,then transformants were screened by uracil auxotrophic medium(SD-URA)with the combination of 5-FOA and uracil.The results showed that the uracil auxotrophic strain was able to grow at the SD-URA medium containing 5-FOA and uracil while the wild-type strains do notgrown.Therefore,an easy and efficientmethod for obtaining auxotrophicYarrowia lipolyticastrain was established in this study.

Yarrowia lipolytica,URA3,gene disruption

Q 819

:A

1673-1689(2010)04-0624-05

2009-09-01

北京市教委科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(KZ200910011001)。

＊通信作者:宋煥祿(1961-),男,山東煙臺(tái)人,工學(xué)博士,教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事食品風(fēng)味化學(xué)及農(nóng)產(chǎn)品深加工方面的研究。Email:songhl@th.btbu.edu.cn