殼聚糖竹醋液復(fù)合膜抗菌活性及其應(yīng)用

廖曉珊, 鐘曉紅, 孟娟, 曾虹燕

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院,湖南長沙 410128;2.湘潭大學(xué)化工學(xué)院生物技術(shù)研究所,湖南湘潭 411105)

殼聚糖竹醋液復(fù)合膜抗菌活性及其應(yīng)用

廖曉珊1,2, 鐘曉紅＊1, 孟娟2, 曾虹燕2

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院,湖南長沙 410128;2.湘潭大學(xué)化工學(xué)院生物技術(shù)研究所,湖南湘潭 411105)

研究了殼聚糖竹醋液復(fù)合涂膜保鮮劑的抗菌抑菌性。測定了殼聚糖和竹醋液的復(fù)配液對細(xì)菌、霉菌的最低抑菌濃度,并研究了不同濃度殼聚糖竹醋液的復(fù)配液對抑菌活性的影響,從而得出最佳復(fù)配液組合為:體積分?jǐn)?shù)0.6%竹醋液和1.0 g/dL殼聚糖。以殼聚糖竹醋液復(fù)配液為主劑,甘油為助劑制成純天然綠色型的復(fù)合保鮮劑水溶液涂膜處理蕨菜,常溫存放進(jìn)行保鮮實(shí)驗。結(jié)果表明:含復(fù)配液體積分?jǐn)?shù)1.5%,體積分?jǐn)?shù)甘油0.6%的涂膜保鮮劑浸泡蕨菜3次,浸泡溫度30℃的條件下對蕨菜進(jìn)行處理。保鮮15 d內(nèi),蕨菜仍為綠色,基本上保持了原有風(fēng)味和營養(yǎng)成分,無霉變。

殼聚糖;竹醋液;抗菌性;保鮮;蕨菜

殼聚糖(Chitosan)是由甲殼素(Chitin)脫乙?；频玫摹Ｓ捎谄滟Y源豐富,無毒,無污染且具有良好的生物相容性和生物可降解性以及抗菌、防腐、止血和促進(jìn)傷口愈合等優(yōu)良性能。殼聚糖有良好的抑菌性、保濕性和成膜性,故作為純天然無毒防腐劑和保濕劑廣泛用于食品工業(yè)[1]。竹醋液是在竹炭生產(chǎn)過程中獲取的液體產(chǎn)品,含有多種有機(jī)成分,p H在2.5～3.0,醋酸含量在2.0～6.0%,含有多種活性成分,具有除臭、殺菌等功效,是良好的天然防腐劑[2]。

近年來,關(guān)于殼聚糖抑菌效果的研究逐漸增多。殼聚糖是一種天然綠色的保鮮劑,對真菌有抑制作用,但相對霉菌的作用最弱[3];竹醋液也是一種良好的天然抑菌劑,對細(xì)菌和霉菌均具有較強(qiáng)的殺滅作用,竹醋液酸度高,有利于增強(qiáng)殼聚糖的抑菌效果。研究了殼聚糖在天然抗菌劑竹醋液的協(xié)同作用下的抗菌抑菌性的影響,并制成復(fù)合保鮮劑涂膜于蕨菜的表面,以期延長蕨菜在室溫下的貯藏時間和提高保鮮質(zhì)量。

1 實(shí)驗與材料

1.1 材料及儀器

細(xì)菌:G+菌[金黃色葡萄球菌(Staphylococcua aureus)枯草桿菌(B acillus subtilis)]G?[大腸桿菌(Escherichia coli);真菌:霉菌[青霉(Penicillium sp.)、黃曲霉(Aspergillus f lavous)]和啤酒酵母(S accharomyces cerevisiae)由湘潭大學(xué)食品與生物工程系提供。殼聚糖購于青島百成海洋資源公司,脫乙酰度為94%以上,相對分子質(zhì)量2.6× 105,由精制竹醋液由瀏陽竹器廠提供,蕨菜采自湘潭市市郊。所用試劑均為分析純。U-2001型紫外分光光度計:由日本日立公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng) 細(xì)菌培養(yǎng):將菌種活化后,接種到蛋白胨培養(yǎng)液中,在37℃搖床培養(yǎng)24 h(120 r/min)。

真菌培養(yǎng):將菌種活化后,接種到PDA瓊脂培養(yǎng)基上,置28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至菌種生長良好。用無菌水將孢子洗出,配成孢子種子液(OD630值0.77)。

1.2.2 最低抑菌濃度的測定 瓊脂培養(yǎng)基加熱熔化后調(diào)p H值為中性,稱取一定量殼聚糖,分別溶解在100 mL不同濃度的竹醋液溶液中,制成含不同質(zhì)量濃度的平板,使其質(zhì)量濃度為2.0、1.5、1.0、0.5 g/dL,然后涂布接種0.2 mL微生物種子液(OD630值0.77),將濾紙片軋成直徑為6 mm的圓紙片,滅菌后用鑷子將濾紙片浸染各種濃度的殼聚糖溶液,貼放于已接種過的平板培養(yǎng)基表面將平板置于恒溫箱(細(xì)菌37℃,真菌28℃)中培養(yǎng),以浸有無菌水濾紙片作空白對照,以上操作均在無菌條件下進(jìn)行。

將上述已接種菌的平板分別在12、24、36、48、60、72、84 h觀察微生物生長情況,每一質(zhì)量濃度作5組平行試驗。用(-)表示無抑菌圈;(+):抑菌圈直徑<6 mm;(++):6 mm<抑菌圈直徑<8 mm; (+++):抑菌圈直徑>8 mm。細(xì)菌和酵母在12 h時和霉菌在24 h時長出被視為無抑制微生物活性;在84 h未有微生物長出視為完全抑制微生物,以完全沒有菌生長的最低濃度為最低抑菌濃度(MIC)。1.2.3 復(fù)合涂膜保鮮劑的制備和蕨菜涂膜預(yù)處理

殼聚糖涂膜液的制備:殼聚糖溶于竹醋液溶液中,加入一定量的甘油作為增塑劑。

蕨菜涂膜預(yù)處理:將蕨菜切去褐變的根部,浸于涂膜液中2 min,自然風(fēng)干。將已成膜的蕨菜放入保鮮袋內(nèi)于室溫下貯藏,同時每隔2 d測其失重率和褐變指數(shù),保鮮天數(shù)為15 d。

褐變指數(shù)[4]:采用目測觀察法,以蕨菜褐變作為分級標(biāo)準(zhǔn):0級:蕨菜完好,梗為綠色或紫色;1級:褐變面積不超過總面積的1/3;2級:褐變面積不超過總面積的1/2;3級:褐變面積占總面積的1/ 2～3/4;4級:褐變面積大于3/4總面積;5級:出現(xiàn)腐爛。

1.2.4 VC測定 滴定法[5]測定蕨菜中的VC。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖的FT-IR分析

如圖1所示,在波數(shù)為3 440 cm-1左右是形成氫鍵締合的-OH伸縮振動吸收峰與-NH的伸縮振動吸收峰重疊而增寬的多重吸收峰。殼聚糖分子中存在著大量的鏈內(nèi)、鏈間氫鍵,因氫鍵的長短和強(qiáng)弱不等,使其伸縮峰出現(xiàn)在一較寬的頻率范圍內(nèi)。殼聚糖在3 440 cm-1(νO-H,νNH2),2 919 cm-1和2 880 cm-1(νC-H),1 420 cm-1(δCH2), 1 151 cm-1(νC-O-C),1 093 cm-1(ν-CHOH-)和1 052 cm-1(ν-CH2OH)均有明顯紅外吸收, 897 cm-1處的紅外吸收是殼聚糖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的振動吸收[6]。

這些吸收峰都來自殼聚糖主鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)。殼聚糖抑菌的有效基團(tuán)-NH3+可以與細(xì)菌細(xì)胞膜上的類脂一蛋白質(zhì)復(fù)合物反應(yīng),使蛋白質(zhì)變性,改變細(xì)胞膜的通透性,或者與細(xì)菌細(xì)胞壁。尤其是革蘭氏陽性菌,細(xì)胞壁較厚,結(jié)構(gòu)緊密,含有豐富的磷壁酸,形成一個負(fù)電荷環(huán)境,殼聚糖損壞細(xì)胞壁的完整性,或使細(xì)胞壁趨于溶解,直至細(xì)胞死亡[7]。

圖1 殼聚糖的紅外圖譜Fig.1 The FI-IR of Chitosan

2.2 殼聚糖復(fù)合液的最低抑菌濃度

在殼聚糖中添加適量竹醋液,能夠增效殼聚糖的抑菌性能。竹醋液是一種組成成分相當(dāng)復(fù)雜的混合物,其中所含有的5-甲基-2-呋喃-甲醛[8]通過破壞蛋白質(zhì)的氫鍵或氨基,使酶等蛋白質(zhì)的活性喪失,從而破壞微生物的正常代謝,抑制了菌體的生長和繁殖。竹醋液還含有醋酸和苯甲酸等有機(jī)酸,對細(xì)菌和真菌均有抑制作用。研究表明酸性條件有利于增強(qiáng)殼聚糖的抑菌效果[9]。

表1中(＊)表示最低抑菌濃度,與殼聚糖相比體積分?jǐn)?shù)0.6%的竹醋液和1.0 g/dL濃度的殼聚糖復(fù)配后的抑細(xì)菌活性和抑制黃曲霉菌活性大大提高,但對啤酒酵母的抑菌活性較低。結(jié)果表明,加入一定濃度的竹醋液,提高了復(fù)配液對細(xì)菌和黃曲霉菌的抑制活性,大大提高了對細(xì)菌的抑制活性,抑菌活性優(yōu)于單純使用殼聚糖或竹醋液。復(fù)配液對黃曲霉菌的抑制效果比單純殼聚糖的抑制效果好,這可能與文獻(xiàn)報道的[10]竹醋液中所含的醛類化合物可直接使黃曲霉菌體蛋白質(zhì)或酶變性,或破壞菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)引起代謝紊亂、降低細(xì)胞膜通透性、影響菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與利用有關(guān)。

用1 g/dL殼聚糖濃度和體積分?jǐn)?shù)0.6%竹醋液濃度配成復(fù)合保鮮劑的抑菌作用較強(qiáng),p H值適中,為殼聚糖竹醋液復(fù)合涂膜保鮮劑抑菌的最佳配比。隨著復(fù)配液的濃度升高,復(fù)配液的p H值逐漸減小,對細(xì)菌和真菌的抑制作用并無顯著增強(qiáng)。一般保鮮劑的p H值在p H4～5之間,過低p H值的復(fù)配液的并不適用果蔬的保鮮。從結(jié)果中可知一定濃度的殼聚糖和酸性的竹醋液之間有著良好的協(xié)同增效作用,所以殼聚糖復(fù)配液比單純的殼聚糖或竹醋液溶液在對細(xì)菌和真菌的抗菌抑菌方面具有更大的優(yōu)越性。

表1 殼聚糖竹醋液復(fù)合液的最低抑菌濃度(MIC)Tab.1 Minimum inhibitory concentration(MIC)of chitosan and Bamboo Vinegar Compound film

續(xù)表1

2.3 復(fù)合涂膜保鮮劑的抗菌保鮮

本文結(jié)合殼聚糖和竹醋液的優(yōu)良特性,以殼聚糖竹醋液復(fù)配液為主劑,甘油為助劑制成復(fù)合保鮮劑。甘油作為增塑劑添加到保鮮劑中,使膜的完整性加強(qiáng)。殼聚糖單純膜性脆,韌性小,加入一些增塑劑能改善其膜性能[11]。甘油對人體無毒無害,而且分子量和同類型的增塑劑(如聚二乙醇)相比較小,其對膜的增塑作用更強(qiáng),更加符合純天然綠色的復(fù)合保鮮劑的要求。

綜合指標(biāo)(E)=70%×褐變指數(shù)+30%×失水率

將復(fù)配液(A)、甘油(B)、溫度(T)和重復(fù)浸泡涂膜次數(shù)(D)進(jìn)行四因素L16(45)正交實(shí)驗,另設(shè)空白對照組。根據(jù)失水率和褐變指數(shù)在貯藏期間保鮮的重要程度確定保鮮綜合指標(biāo)(E),并以該指標(biāo)評價復(fù)合保鮮劑的保鮮效果。采用正交試驗法優(yōu)化配比,優(yōu)選最佳濃度配比的復(fù)配液和甘油濃度制成復(fù)合保鮮劑。

從表2看出,影響涂膜效果因素的主次順序為復(fù)配液>甘油>重復(fù)浸泡涂膜次數(shù)>溫度。另對照組的失重率為46%,褐變指數(shù)為100%,綜合指標(biāo)為82.8%,該復(fù)合保鮮劑保持水分和抗褐變的能力顯著高于對照組。在最佳條件(A2B3C3D3)下,追加3次驗證,其保鮮綜合指標(biāo)分32.02%,33.18%和34.56%,平均為33.25%。因此確定實(shí)驗用體積分?jǐn)?shù)1.5%的復(fù)配液和0.6%的甘油增塑劑配制成涂膜液,在30°C溫度下將蕨菜浸入涂膜液3次,可達(dá)到其最佳保鮮效果。同時,對剛采摘的新鮮蕨菜和涂膜處理的蕨菜中的VC含量進(jìn)行測定,并以未經(jīng)任何處理的蕨菜作為對照組,新鮮蕨菜、涂膜處理蕨菜和對照組的VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為26.842、8.052和6.321 mg/100g。新鮮蕨菜的VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,達(dá)25mg/100g(鮮重)以上。隨著貯藏時間的延長,涂膜組和對照組的VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)均明顯減少。但涂膜組的蕨菜的VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)損失略少于對照組,說明殼聚糖復(fù)合保鮮劑涂膜對還原型VC有一定的保護(hù)。

表2 復(fù)合保鮮劑正交涂膜試驗的結(jié)果Tab.2 Membrane of compound coating antistaling agent’s result of orthogonal design

續(xù)表2

3 結(jié) 語

殼聚糖竹醋液復(fù)合涂膜保鮮劑對G+菌、G-菌、黃曲霉菌和酵母菌均有較強(qiáng)的抑菌作用,其中殼聚糖對細(xì)菌的抑制作用大于竹醋液;而竹醋液對真菌的抑制效果方面強(qiáng)于殼聚糖的抑制效果,竹醋液在復(fù)合涂膜保鮮劑中更是對殼聚糖的抗菌抑菌性起到協(xié)同增效的作用。用1 g/dL殼聚糖濃度和體積分?jǐn)?shù)0.6%竹醋液濃度配成復(fù)合保鮮劑的抑菌作用較強(qiáng),p H值適中,為殼聚糖竹醋液復(fù)合涂膜保鮮劑抑菌的最佳配比。當(dāng)殼聚糖復(fù)配液的濃度逐漸升高后,對細(xì)菌和真菌的抑制作用并無增強(qiáng)。

以殼聚糖竹醋液復(fù)配液為主劑,加入甘油為助劑配置成復(fù)合保鮮劑,對蕨菜進(jìn)行涂膜保鮮試驗。研究結(jié)果表明:隨著貯藏時間的延長,水分、維生素C含量不斷下降,經(jīng)保鮮劑處理過的蕨菜含水量、維生素C的含量均高于對照。最佳組合為復(fù)配液1.5 g/dL,甘油0.6 g/dL,浸泡溫度30℃,浸泡次數(shù)3次。的復(fù)合保鮮劑為純天然綠色的復(fù)合保鮮劑,對人體無毒無害并且對蕨菜有較好的保鮮效果。在保鮮15 d內(nèi),隨著貯藏時間的延長,水分、VC含量不斷下降,但經(jīng)復(fù)合保鮮劑處理過的蕨菜含水量、VC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于對照,延緩蕨菜褐變的發(fā)生,從而延長蕨菜的貨價保藏期。

[1]劉碧源,高仕英.殼聚糖及其衍生物的抗微生物活性研究進(jìn)展[J].中國生化藥物雜志,2003,24(5):268-270.

LIU Bi-yuan,GAO Shi-ying.Progress of research on antimicrobial activity of chitosan and its derivative[J].Chinese Journal of Biochemical Pharraaceutic,2003,24(5):268-270.(in Chinese)

[2]馬良進(jìn),張盺,陳曉玲等.竹醋液與殺菌劑混配的抑菌效果[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報,2008,36(8):29-42.

MA Liang-jin,ZHANG xin,CHEN Xiao-ling,et al.Inhibition efrect of bamboo vinegar mixed with fungicide[J].Journal of Northeast Forestry University,2008,36(8):29-42.(in Chinese)

[3]夏文水,張帆,何新益.甲殼低聚糖抗菌作用及其在食品保藏中的應(yīng)用[J].無錫輕工業(yè)大學(xué)學(xué)報,1998,17(4):10-14.

XIA Wen-shui,ZHANG Fan,HE Xin-yi.Antimicrobial of chitooligosaccharjdes and its application to food preservation [J].Journai of WuXi Unvercity of light industry,1998,17(4):10-14.(in Chinese)

[4]吳錦鑄,張昭其.果蔬保鮮與加工[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2001.

[5]王云霞,張會輕,郭磊.滴定法測定維生素C含量[J].河北化工,2008,31(8):72-73.

WANG Yun-xia,ZHANG Hui-qing,GUO Lei.The discussion of titrimetric method of vitamin C content[J].Hebei Chemical Engineering and Industry,2008,31(8):72-73.(in Chinese)

[6]姚倩,孫濤,徐軼霞,等.殼聚糖/殼寡糖衍生物的制備及其抗氧化性能研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報,2009,28(2):188 -191.

YAO Qian,SUN Tao,XU Yi-xia,LIU Yan-yang.Preparation of chitosan/chitosan oligosaccharide derivatives and their antioxidant activities[J].Journal of Food Science and Biotechnology,2009,28(2):188-191.(in Chinese)

[7]成慶利.殼聚糖的結(jié)構(gòu)及抗菌作用研究進(jìn)展[J].生物技術(shù),2006,16(4):88-90.

CHENG.Qing-li.Research on the structure and antimicrobial activity of chitosan and its derivatives[J].Biotechnology, 2006,16(4):88-90.(in Chinese)

[8]羅曼,鄒國林.檸檬醛抑制黃曲霉生長相關(guān)機(jī)理的研究[J].武漢大學(xué)學(xué)報(理學(xué)版),2001,.

LUO Man,ZOU Guo-lin.Study of the relative mechanism for citral antigrowth to aspergillus flavus[J].Wuhan University Journal(Natural Science Edition),2001,47(6):745-751.(in Chinese)

[9]王科兵,王芳宇.殼聚糖及其衍生物抗菌作用的研究進(jìn)展[J].臨床軍醫(yī)雜志,2007,35(6):937-939.

WANG Ke-bing,WANG Fang-yu.Antimicrobial properties of chitosan and its derivatives research progress[J].Clin J Med office,2007,35(6):937-939.(in Chinese)

[10]徐小平,李忠琴,歐敏瑞等.竹瀝組分分析及抑菌作用[J].無錫輕工大學(xué)學(xué)報.2004,23(1):37-44.

XU Xiao-ping,Li Zhong-qin,et al.Analysis of bamboo vinegar and its antimicrobial actions[J].Journal of Wuxi University of Light Industry,2004,23(1):37-44.(in Chinese)

[11]王秀娟,張坤生.增塑劑對殼聚糖膜性能的影響[J].食品研究與開發(fā).2008,29(9):7-10.

WANG Xiu-juan,Zhang Kun-sheng.Study on ultrasonic extractionmethod of red plgment in pyracantha fortuneana,2008, 29(9):7-10.(in Chinese)

(責(zé)任編輯:楊萌)

Antimicrobial Properties and Application of Composite Film from Chitosan and Bamboo Vinegar

LIAO Xiao-shan1, ZHONG Xiao-hong＊1, MENGJuan2, ZENG Hong-yan
(1.College of Landscape Gardening and Horticulture,Hunan Agriculture University,Changsha 410128,China;2. Biotechnology Institute,College of Chemical Engineering,Xiangtan University,Xiangtan 411105,China)

The antimicrobial properties of Compound film of Chitosan and bamboo vinegar were studied in this manuscript.The optimum combination of liquid mixtures with 0.6%bamboo vinegar and 1.0 g/dL chitosan was firstly determined by evulating thethe minimum concentration (MIC)and the inhibitory activity of the film.Compound preservations were made with chitosan and bamboo vinegar mixture as main reagents and glycerol as the auxiliary.The water solutions of the compound preservations with different concentrations were filmed on the surface of the bracken,and then preserved atroom temperature.The results showed thatthe coating antistaling agent contained compound preservations 1.5%and glycerin 0.6%.Kept the bracken three time marinated into the coating antistaling agent at 30℃temperature.The preserved bracken mainly kept its original taste and nutritious value,and remained green without mildew. Key words:chitosan,bamboo vinegar,antimicrobial properties,bracken

TS 201.3

:A

1673-1689(2010)03-0395-06

2009-05-10

國家農(nóng)業(yè)公益性行業(yè)科研基金專項項目(200803036)。

＊通信作者:鐘曉紅(1961-)女,湖南華容縣人,工學(xué)博士,教授,博士生導(dǎo)師。主要從事果品采后加工及果蔬保鮮方向的研究。Email:xh-zhong@163.com