椰心葉甲幼蟲被寄生后體壁主要物質(zhì)含量的變化

孫蕊芬，龔聲輝，姜迎婭，朱 麟

（海南師范大學(xué) 海南省熱帶動植物生態(tài)學(xué)重點實驗室，海南 ?？?571158）

椰心葉甲幼蟲被寄生后體壁主要物質(zhì)含量的變化

孫蕊芬，龔聲輝，姜迎婭，朱 麟*

（海南師范大學(xué) 海南省熱帶動植物生態(tài)學(xué)重點實驗室，海南 ?？?571158）

椰心葉甲幼蟲被寄生后體壁逐步硬化，幾丁質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂類等主要組分含量發(fā)生變化.石油醚溶解脂肪法、飽和KOH消化幾丁質(zhì)法、考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法測定蛋白質(zhì)，分析各組分含量變化.結(jié)果顯示：被寄生幼蟲表皮總脂肪相對含量7.59％，未寄生11.80％；被寄生幼蟲表皮幾丁質(zhì)相對含量63.12％，未寄生58.10％；被寄生幼蟲表皮蛋白質(zhì)相對含量3.62％，未寄生13.26％，說明幼蟲被寄生后體壁脂肪和蛋白質(zhì)部分被寄生蜂利用.SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳分析被寄生幼蟲體壁蛋白種類，比未寄生多出3條條帶，缺失2條條帶，說明幼蟲被寄生后蛋白質(zhì)種類有變化.

體壁；脂肪；幾丁質(zhì)；蛋白質(zhì)

寄生蜂寄生后可引起寄主體內(nèi)發(fā)生復(fù)雜的生理生化反應(yīng)（梁光紅，2007），椰心葉甲幼蟲被寄生后體壁由乳白色變暗為棕黑色，逐步硬化.昆蟲表皮的化學(xué)成分包括幾丁質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂類、多元酚及其氧化酶、色素.昆蟲的體壁是體軀的最外層組織，由單一的細(xì)胞層及其分泌物所組成，由里向外可分為底膜、皮細(xì)胞層和表皮層.既能防止體內(nèi)水分的蒸發(fā)，又能防止外來物質(zhì)如病原體、殺蟲劑等的侵襲，作為營養(yǎng)物質(zhì)的儲備庫，在蟲體饑餓和脫皮過程中，體壁內(nèi)儲存的營養(yǎng)物質(zhì)可被消化和利用（彩萬志，2004）.本實驗測定椰心葉甲幼蟲寄生后體壁各物質(zhì)含量的變化.

1 材料和方法

1.1 總脂肪、幾丁質(zhì)提取及相對含量分析

寄生和未寄生的椰心葉甲幼蟲均采自?？谑薪紖^(qū)受害椰樹，選取3～4齡椰心葉甲幼蟲各200只.蒸餾水沖洗干凈，未寄生幼蟲將蟲體沿腹中線縱向剖開，去除消化道、脂肪體和肌肉層后，將體壁用蒸餾水沖洗干凈，60℃烘干至恒重，用電子天平（精確到0.000 1）稱質(zhì)量（w1），加入10倍質(zhì)量的石油醚，超聲波提取5 min后取出溶劑，再加入石油醚，反復(fù)提取5次后，加入20～30倍質(zhì)量的石油醚振蕩提取8 h.將脫脂后的表皮于60℃烘干至恒重，稱質(zhì)量（w2），w1與w2的差值（w1-w2）即為總脂肪含量.將脫脂后的干表皮用飽和KOH溶液甘油浴160℃消化30 min，堿解蛋白質(zhì)后剩余透明幾丁質(zhì)殘基，流水沖洗，再分別經(jīng)體積分?jǐn)?shù)95％和100％的乙醇脫水，稱質(zhì)量即得幾丁質(zhì)含量（w3），參考陳長琨的方法.寄生幼蟲解剖蟲體，剔除寄生蜂，方法同上.

1.2 體壁蛋白質(zhì)提取和含量測定

寄生和未寄生椰心葉甲幼蟲分別取200頭剝離體壁，蒸餾水沖洗干凈，濾紙吸干體表水分后稱重，移入預(yù)冷的玻璃勻漿器中，加入1.2mL磷酸鹽緩沖液（0.02mol/L，pH7.0）充分研磨，4℃，10 000 r/ min離心15 min，取上清-20℃保存?zhèn)溆?

考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法測定蛋白質(zhì)含量（陳鈞輝，2007）.取7支10 mL離心管，分別加入0.1mg/mL牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL，不足1.0 mL者以雙蒸水補(bǔ)足至1.0 mL.每管中均加入考馬斯亮藍(lán)G-250溶液5 mL，混合均勻，放置2～3 min后，在595 nm波長下比色法測定吸光值.重復(fù)3次，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

準(zhǔn)確吸取上述蛋白質(zhì)提取液，用雙蒸水補(bǔ)足至1.0 mL，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，充分混勻后在595 nm波長下比色，記錄吸光值，查閱標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算寄生和未寄生幼蟲蛋白質(zhì)含量.

1.3 SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳

將樣品與2×上樣緩沖液（含4％SDS、10％巰基乙醇、20％甘油、0.000 1溴酚藍(lán)）1∶1混勻，于沸水中煮3 min.采用垂直電泳儀，分離膠10％，濃縮膠4％電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)指示線遷移至距下沿約1 cm時停止電泳.取下凝膠，考馬斯亮藍(lán)染色，冰乙酸和酒精脫色，凝膠成像清晰后拍照并分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 總脂肪、幾丁質(zhì)、蛋白質(zhì)相對含量分析

剝離200只椰心葉甲幼蟲表皮60℃烘干恒重后，稱量被寄生表皮總重平均0.212 3 g，未寄生表皮總重平均0.200 2 g，說明寄生前后表皮各物質(zhì)總重量變化不大，經(jīng)過測定分析，被寄生幼蟲表皮總脂肪相對含量7.59％，未寄生11.80％；被寄生幼蟲表皮幾丁質(zhì)相對含量63.12％，未寄生58.10％，說明幼蟲被寄生后，一部分脂肪被利用，幾丁質(zhì)含量差異不大；被寄生幼蟲表皮蛋白質(zhì)相對含量3.62％，未寄生13.26％，相差4倍，說明幼蟲被寄生后大部分蛋白質(zhì)被利用（見表1）.

表1 椰心葉甲幼蟲寄生后表皮總脂肪、幾丁質(zhì)、蛋白質(zhì)相對含量Tab.1 Content of totalfats，chitin，totalprotein of parasitoid larvae's integument

2.2 SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

外源入侵的異物浸入昆蟲體后被蟲體識別為非自身物質(zhì)并誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)等（蔣紅波，2006）.由于寄生后，幼蟲體壁蛋白含量變化較大，隨即進(jìn)行蛋白條帶分析，如圖1所示，被寄生中條帶數(shù)目增多，條帶1，2，3，較明顯，缺失4，5兩條較明顯，說明寄生后，體壁蛋白種類發(fā)生變化，參與免疫反應(yīng)和自身保護(hù)調(diào)節(jié).

3 討論

寄主與寄生蜂之間的防御和反防御作用是二者在長期協(xié)同進(jìn)化過程中形成的重要機(jī)制，寄主昆蟲防御外源入侵除了采取一些體外物理防御措施外，主要采用細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)（梁光紅，2007）.寄生蜂對寄主生長發(fā)育、血淋巴蛋白質(zhì)含量、血細(xì)胞含量、糖原含量、酚氧化酶活性及各類激素調(diào)解等產(chǎn)生影響（李季生，2006）.

椰甲截脈姬小蜂寄生椰心葉甲幼蟲數(shù)天后寄主死亡.羽化出蜂前，寄主表皮逐漸堅硬，完好得保護(hù)寄生蜂成功羽化，在這一過程中，體壁各物質(zhì)組分發(fā)生變化，其中蛋白質(zhì)72.72％、脂類50.97％被利用，幾丁質(zhì)增加13.01％.蛋白質(zhì)種類有變化，說明體壁也參與了免疫反應(yīng).

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責(zé)任編輯：黃 瀾

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責(zé)任編輯：畢和平

Influence of Parasitoid Wasp on Integument CoMponents of Brontispa longissima（Gestro）Larvae

SUN Ruifen，GONG Shenghui，JIANG Yingya，ZHU Lin*
（College of Life sciences，Hainan Normal University，Hainan Provincial Key Laboratory of Tropical Plant and Animal Ecology，Haikou 571158，China）

The integument sclerosis occured after Brontispa longissima（Gestro）larvae were parasitized，the content of it's components changed.Though dissolving fats with mineral ether，digesting chitin wicth saturated KOH，detecting protein with coomassie brilliant blue，content of totalfats of parasitoid larvae is 7.59％，healthy larvae is 11.80％；Content of chitin of parasitoid larvae is 63.12％，healthy larvae is 58.10％；Content of totalprotein of parasitoid larvae is 3.62％，healthy larvae is 13.26％.The result indicated that the fats and protein were used by parasitoid wasps.SDSPAGE analysis of kinds of protein of parasitoid larvae's integument showed addition of 3 tapes and missing of 2 tapes，which indicated that the kinds of protein changed after parasitized.

integument；fats；chitin；protein

Q 966

A

1674-4942（2010）03-0306-02

2010-06-17

海南省教育廳椰心葉甲兩種寄生蜂熱激蛋白的表達(dá)研究資助項目（HxWsy2009-20）

*通訊作者