四種重要致病性分枝桿菌DHPLC檢測鑒別方法的建立*

陳 茹,畢英佐,劉志玲,劉志輝,馬靜云,曾碧健,吳曉薇,周 科,林志雄

2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué);

3.廣州市胸科醫(yī)院;

四種重要致病性分枝桿菌DHPLC檢測鑒別方法的建立*

陳 茹1,畢英佐2,劉志玲2,劉志輝3,馬靜云2,曾碧健1,吳曉薇1,周 科1,林志雄1

目的運用多重核酸擴增(PCR)聯(lián)合變性高效液相色譜(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)分析技術(shù)原理,針對結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、禽分枝桿菌以及副結(jié)核分枝桿菌建立多重PCR-DHPLC快速檢測方法,實現(xiàn)同時檢測鑒別四種重要致病性分枝桿菌。方法根據(jù)四種分枝桿菌特異基因序列分別設(shè)計菌種特異核酸擴增引物,通過篩選優(yōu)化試驗建立四重核酸擴增體系,對核酸擴增產(chǎn)物采用DHPLC設(shè)備進行檢測分析,每一菌種的核酸擴增產(chǎn)物分別形成DHPLC特征峰圖。對結(jié)核分枝桿菌等51株分枝桿菌標準株和分離株樣品以及沙門氏菌等22株常見微生物樣品進行特異性檢測試驗;對四種分枝桿菌特異的核酸擴增產(chǎn)物分別制備克隆質(zhì)粒,通過對梯度稀釋的陽性質(zhì)粒的檢測試驗,進行多重PCR-DHPLC靈敏度測試;對疑似病人痰液樣品和疑似發(fā)病牛的組織樣品進行檢測,并與細菌分離培養(yǎng)法進行比較以驗證臨床檢測效果。結(jié)果該方法能快速檢測鑒別上述四種分枝桿菌,檢測靈敏度達到102～103基因拷貝,從131份疑似病人臨床樣品中檢出91份結(jié)核分枝桿菌陽性,從40份來自疑似發(fā)病牛群的臨床樣品中檢出31份牛分枝桿菌陽性,檢出率均高于細菌分離培養(yǎng)法。結(jié)論研究表明所建立的多重PCR-DHPLC方法能快速檢測鑒別四種重要致病性分枝桿菌,為人畜結(jié)核、副結(jié)核病診斷提供一種新型分子生物學(xué)技術(shù)手段。

變性高效液相色譜;結(jié)核分枝桿菌;牛分枝桿菌;禽分枝桿菌;副結(jié)核分枝桿菌;多重PCR

2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué);

3.廣州市胸科醫(yī)院;

Email:chenr@iqtc.cn;ychenru@sina.com

分枝桿菌在自然界廣泛存在,迄今已發(fā)現(xiàn)的有上百種,多數(shù)菌種對人畜有致病性〔1〕。其中,結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)與牛分枝桿菌(M.bovis)主要感染人與哺乳動物引起結(jié)核病;禽分枝桿菌(M.avium)感染禽類引起禽結(jié)核,也可感染人與家畜引起非典型肺炎;副結(jié)核分枝桿菌(M.paratubercu-losis)在分類上屬禽分枝桿菌復(fù)合群,主要感染牛、羊等反芻動物引起副結(jié)核病。結(jié)核病危害嚴重,已成為全球主要公共衛(wèi)生問題。結(jié)核病、副結(jié)核病均為國際動物貿(mào)易重點監(jiān)控疫病,我國動物進出境檢疫工作規(guī)定對這兩種疫病實施嚴格的檢疫。結(jié)核、副結(jié)核病的診斷主要涉及上述四種重要致病性分枝桿菌的檢測鑒別。

分枝桿菌具有形態(tài)與結(jié)構(gòu)相似,抗原交叉嚴重,常規(guī)診斷方法不易區(qū)分的特點,且各種分枝桿菌可在人畜禽間感染傳播。準確檢測鑒別不同致病性分枝桿菌可幫助查清結(jié)核病、副結(jié)核病傳染源和傳播途徑,避免由于常規(guī)診斷方法特異性不理想造成錯誤撲殺動物等不必要的經(jīng)濟損失。另一方面,禽分枝桿菌等非結(jié)核分枝桿菌感染人引起的臨床癥狀和病理變化與結(jié)核分枝桿菌的感染相似,而由于對抗結(jié)核藥物不敏感,對大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌需采取不同的治療手段〔1〕。因此,針對重要致病性分枝桿菌建立菌種特異的檢測鑒定方法具有重要的流行病學(xué)意義和臨床診療意義。

變性高效液相色譜(Denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)技術(shù)是一種利用離子對反相液相色譜技術(shù)原理進行核酸片段的分離和分析的新型核酸分析技術(shù),可應(yīng)用于進行微生物檢測鑒別,具有高通量和自動化,準確性好,成本低等優(yōu)勢,國內(nèi)外已見報道用于進行大腸桿菌等食品微生物的檢測鑒別〔2-4〕、致病微生物耐藥菌株的鑒別篩選以及遺傳疾病的基因診斷〔5-7〕等。DHPLC技術(shù)根據(jù)核酸檢測分析要求,可采用非變性、部分變性和完全變性幾種不同的分析模式,基于核酸擴增片段差異的微生物鑒別檢測技術(shù)采用非變性分析模式。本文采用多重核酸擴增與非變性DHPLC分析相結(jié)合的技術(shù)原理,首次建立了同時快速檢測鑒別結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、禽分枝桿菌和副結(jié)核分枝桿菌的四重PCR-DHPLC高通量檢測分析方法,詳見如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 副結(jié)核分枝桿菌標準菌株購自中國獸醫(yī)與藥品監(jiān)督所(CVCC),其余分枝桿菌標準菌株均源自美國ATCC菌種保藏中心,卡介苗干粉(BCG)為蘭州生物制品研究所產(chǎn)品(凍干皮內(nèi)注射用卡介苗,批號20000912,含 106菌細胞/mg以上);結(jié)核分枝桿菌分離株樣品由廣州市胸科醫(yī)院分離保存,牛分枝桿菌分離株樣品由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)保存,禽分枝桿菌分離株樣品、副結(jié)核分枝桿菌分離株樣品由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)保存。其它各種微生物標準菌株樣品均購自中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心(CMCC)或美國ATCC菌種保藏中心,分離株樣品由汕頭出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心提供。詳見表1。

1.1.2 主要試劑 PCR擴增用酶,采用TOYOBO公司KOD-PLUS DNA polymerase。三乙胺乙酰鹽(T EAA,色譜純)購自T ransgenomic公司,乙睛(色譜純)購自TEDIA公司。

1.1.3 主要儀器 變性高效液相色譜儀(Transgenomic Wave 4500),核酸擴增儀(PE2700)。

1.2 目標基因選擇與引物設(shè)計 參考文獻報導(dǎo),選取各菌種特異序列,采用專業(yè)軟件設(shè)計對應(yīng)擴增引物。結(jié)核分枝桿菌引物設(shè)計以該菌種基因組中一段特異的12.7kb插入序列(GenBank Accession No.:CP000717)為模板,擴增產(chǎn)物 213 bp,對應(yīng)模板1702125bp～1702337bp位點(5'～3')序列;牛分枝桿菌引物設(shè)計以該菌種特異的一段229bp序列(GenBank Accession No.:AM408590)為模板,擴增產(chǎn)物241bp,對應(yīng)模板1721081bp～1721321bp位點序列;副結(jié)核分枝桿菌引物設(shè)計以IS900插入序列(GenBank Accession No.:AY660657)為模板,擴增產(chǎn)物302bp,對應(yīng)模板61bp～361bp位點序列;禽分枝桿菌引物設(shè)計以IS1245插入序列(GenBank Accession No.:L33879)為模板,擴增產(chǎn)物265bp,對應(yīng)模板88bp～352bp位點序列。

1.3 分枝桿菌基因組DNA提取 從菌液、痰液、血液中提取分枝桿菌核酸的方法按文獻〔8〕進行。從淋巴結(jié)、肺等臨床樣品中提取分枝桿菌核酸按以下方法操作:取適量淋巴結(jié)等組織(剔除脂肪、筋膜),按1∶2(W/V)加檸檬酸鈉-磷酸緩沖液,充分研磨成乳劑,加等量4%NaOH溶液繼續(xù)研磨使組織液化,75℃溫浴0.5～1 h,取懸浮液(避免吸取粗渣),高速離心取沉淀,加滅菌0.01 mol/L pH 7.6 PBS 1mL洗 2次,取沉淀,加入 50 μ L DNA 提取液,56℃溫浴30 min,98℃～100℃溫浴10 min,加入等體積氯仿,振蕩混勻后,離心取上清直接用于擴增反應(yīng)。

1.4 陽性克隆質(zhì)粒 通過PCR擴增各菌種特異基因片段(含1.2對應(yīng)PCR產(chǎn)物),按常規(guī)基因克隆操作把PCR產(chǎn)物分別克隆到pMD19-T載體,構(gòu)建的克隆質(zhì)粒pMD19-M T,pMD19-MB,pMD19-PB9,pMD19-MA12質(zhì)粒分別含結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、副結(jié)核分枝桿菌、禽分枝桿菌特異擴增序列,可作為本研究DHPLC檢測陽性對照模板及敏感性試驗?zāi)０濉?/p>

表1 試驗菌種與編號列表Table 1 List of tested bacterial strains

1.5 多重PCR體系和擴增條件 通過對引物用量、擴增循環(huán)條件等因素的比對優(yōu)化試驗,確定最佳反應(yīng)體系如下:采用50μ L反應(yīng)體系,反應(yīng)液中含dNTP 0.2 mmol/L,八條引物每條各 0.2 μ mmol/L,Mg2+1.0 mmol/L,1 unit Taq酶;擴增循環(huán)條件為:94℃2min;94℃15s,62℃5s,68℃5s,35個循環(huán);72℃,1min。

1.6 DHPLC分析條件 在非變性分析模式下,采用雙鏈DNA多片段(double-stranded multiple fragment)分析模式,清洗模式采用active,樣品進樣量設(shè)為5μ L。分析檢測過程儀器梯度參數(shù)由Navigator software分析軟件控制設(shè)定。

1.7 臨床樣品的細菌分離培養(yǎng) 采用改良羅氏培養(yǎng)法,其中人臨床樣品的細菌分離培養(yǎng)鑒定試驗由廣州市胸科醫(yī)院按醫(yī)院標準規(guī)程完成;動物臨床樣品的細菌分離培養(yǎng)鑒定試驗由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)按標準方法(GB/T 18645-2002)完成。

1.8 特異性試驗 采用1.6的四重PCR反應(yīng)體系和擴增條件,對表1中各菌種基因組DNA進行PCR擴增,按1.6進行擴增產(chǎn)物的DHPLC檢測分析,對所建立的四重PCR-DHPLC體系進行特異性試驗。

1.9 敏感性試驗 按1.4制備各菌種對應(yīng)的陽性模板克隆質(zhì)粒,對四種質(zhì)粒進行提取純化后,測OD260吸光度值并換算成濃度值,根據(jù)公式:質(zhì)粒拷貝數(shù)/μ l={總含量(μ g/μ l)}/{質(zhì)粒分子堿基數(shù) ×10-15μ g},換算成質(zhì)粒單位體積對應(yīng)的基因拷貝數(shù),然后將每種質(zhì)粒DNA分別進行10倍系列稀釋,取每一稀釋度質(zhì)粒DNA樣品進行四重PCR-DHPLC分析,每個稀釋度均做2次以上重復(fù)試驗,根據(jù)檢測終點稀釋度推算檢測終點對應(yīng)的基因拷貝數(shù)。

1.10 臨床檢測試驗 取臨床采集的人痰液樣品、牛(淋巴結(jié)、牛肺)組織樣品,分別進行細菌分離培養(yǎng)和四重PCR-DHPLC檢測分析,并對2種方法的檢測結(jié)果進行比較。

2 結(jié) 果

2.1 四重PCR-DHPLC特異性試驗結(jié)果 按1.5、1.6對表1所列的50株分支桿菌菌株樣品和沙門氏菌等24株其它微生物樣品進行四重PCR擴增和DHPLC分析。結(jié)果顯示,四重PCR-DHPLC能同時準確檢測鑒別結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、副結(jié)核分枝桿菌與禽分枝桿菌,對這四種目標菌種的標準株和分離株樣品的檢測分析結(jié)果均出現(xiàn)相符的DHPLC特征峰圖,而同時檢測其它分枝桿菌以及各種常見微生物樣品均無非特異性反應(yīng),在DHPLC分析圖譜中未出現(xiàn)與上述四種目標菌種一致的特征峰圖。圖1顯示上述四種分枝桿菌標準菌株單重模板以及四重模板(即將四種分枝桿菌DNA樣品等量混合后作為四重擴增的模板)擴增產(chǎn)物的DHPLC分析標準特征圖譜,圖中還顯示部分陰性菌株樣品的檢測圖譜。圖2分別顯示四種分枝桿菌的標準株與分離株樣品的檢測分析結(jié)果,結(jié)果表明每一菌種的標準株與分離株樣品均呈現(xiàn)穩(wěn)定的DHPLC特征圖譜。

圖1 分枝桿菌的DHPLC特征圖譜1:四重菌種模板檢測圖譜;2:結(jié)核分枝桿菌;3:牛分枝桿菌;4:禽分枝桿菌;5:副結(jié)核分枝桿菌;6:部分陰性菌種檢測圖譜.Fig.1 DHPLC standard chart of Mycobacteria strains1.Quadruplex templates;2.M.tuberculosis;3.M.bovis;4.M.avium;5.M.paratuberculosis;6.Negative strains.

2.2 四重PCR-DHPLC敏感性試驗 按1.9進行敏感性試驗與數(shù)據(jù)處理,以1.4所列四種陽性克隆質(zhì)粒DNA系列稀釋的樣品為模板,進行四重PCR擴增和DHPLC分析檢測。結(jié)果顯示,四重 PCRDHPLC對結(jié)核分枝桿菌,牛分枝桿菌,副結(jié)核分枝桿菌,禽分枝桿菌陽性模板克隆質(zhì)粒的檢測敏感性可達 10-8到10-9稀釋度,相當(dāng)于約102～103個基因拷貝。

2.3 臨床樣品檢測試驗結(jié)果 從醫(yī)院肺炎門診采集疑似病人痰樣131份,從呈現(xiàn)疑似臨床癥狀的牛群中采集牛肺、牛淋巴結(jié)、牛血液等臨床樣品40頭份,采用四重PCR-DHPLC方法和細菌分離培養(yǎng)方法分別進行檢測試驗。檢測結(jié)果,采用兩種方法均從人痰樣中檢出結(jié)核分枝桿菌陽性樣品(未檢出其它3種分支桿菌),四重PCR-DHPLC方法的檢出率為69.5%(91/131),細菌分離培養(yǎng)法的檢出率為63.3%(83/131);采用兩種方法均從牛臨床樣品中檢出牛分枝桿菌陽性(未檢出其它3種分枝桿菌),四重PCR-DHPLC方法和細菌分離培養(yǎng)法檢出率分別為77.5%(31/40)、62.5%(25/40)。對171份臨床樣品的檢測試驗表明,四重PCR-DHPLC方法對人與動物臨床樣品的檢出率均高于細菌分離培養(yǎng)方法,其中,細菌分離培養(yǎng)呈陽性的樣品均呈PCRDHPLC陽性。詳見表2。

圖2 四種分枝桿菌的標準株與分離株DHPLC檢測分析結(jié)果Fig.2 DHPLC analysis of different strains of four species of Mycobacterium.

3 討 論

傳統(tǒng)的分枝桿菌檢測鑒定方法包括鏡檢法和細菌分離培養(yǎng)法。鏡檢法敏感性低,不能進行菌種鑒定,而培養(yǎng)法耗時長。由于分枝桿菌生長緩慢,細菌分離培養(yǎng)常需數(shù)周時間,培養(yǎng)后還需進行各種繁瑣的生化反應(yīng)才能鑒定菌種,同時必須是“活菌”才能培養(yǎng)成功,因此傳統(tǒng)的細菌學(xué)檢查鑒定方法有其局限性,不利于疫情疫病快速確診和臨床治療,也不能適應(yīng)人員或動物進出境檢驗檢疫快速通關(guān)要求。

表2 四重PCR-DHPLC與細菌分離培養(yǎng)對臨床樣品的檢測結(jié)果比對Table 2 Comparison of quadruple PCR-DHPLC and culture method for detection of clinical samples

近年來,以PCR和實時熒光PCR為代表的分子生物學(xué)技術(shù)在結(jié)核或副結(jié)核病原菌快速檢測鑒定方面發(fā)展較快〔8-10〕,但均為針對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群或副結(jié)核分枝桿菌等單一菌種,其中以熒光PCR方法最為敏感,但成本較高。由于多重實時熒光PCR技術(shù)還不成熟,對于同時檢測多種相近的病原菌需要建立多套熒光PCR方法,在實際應(yīng)用方面成本高的問題更為突出。因此,在重要致病性分枝桿菌快速檢測鑒定方面進行新方法、新技術(shù)手段的研究開發(fā)具有現(xiàn)實意義。結(jié)核與副結(jié)核病的診斷涉及到多種致病性分枝桿菌的檢測鑒別,適合運用DHPLC等高通量檢測技術(shù)手段。目前已報導(dǎo)的相關(guān)DHPLC技術(shù)研究主要用于進行結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株的篩選鑒別〔11-12〕,即對分離培養(yǎng)獲得的純菌株采用DHPLC變性分析模式尋找確認耐藥基因突變位點。在不同種分枝桿菌鑒別方面,僅有國內(nèi)1篇文獻報導(dǎo)采用DHPLC異源雙鏈突變檢測分析方法(部分變性分析模式)鑒別結(jié)核分枝桿菌與牛分枝桿菌〔13〕,僅限于對 1～2株標準菌株進行檢測試驗。

國際上DHPLC技術(shù)的相關(guān)研究進展迅速,已成為核酸分析技術(shù)研究與應(yīng)用的一個熱點。采用DHPLC技術(shù)一次可自動分析數(shù)十甚至數(shù)百個樣品,實現(xiàn)了對核酸分子的高通量自動化分析,其特征圖譜可精確到幾個堿基的差異,不僅避免了常規(guī)PCR電泳檢測的繁瑣和易造成污染等問題,準確性也顯著提高,其試劑成本僅相當(dāng)于常規(guī)PCR,在實際應(yīng)用方面有優(yōu)勢。將DHPLC技術(shù)與核酸擴增技術(shù)相結(jié)合建立新型核酸分析手段,在微生物的快速檢測鑒別等方面具有很大的開發(fā)應(yīng)用潛力。本研究采用多重核酸擴增聯(lián)合非變性DHPLC分析方法,對結(jié)核分枝桿菌等四種重要致病性分枝桿菌建立了PCR-DHPLC鑒別檢測分析手段。與國內(nèi)報導(dǎo)的單重PCR擴增聯(lián)合DHPLC分析檢測微生物的研究工作不同,本研究可通過一次反應(yīng)同時檢測鑒別四種目標菌種,當(dāng)待檢樣品中僅含有一種菌種時,其DHPLC分析圖譜僅出現(xiàn)一個特征峰型,當(dāng)樣品中同時含有多個目標菌種時,其DHPLC分析圖譜將同時呈現(xiàn)多個吸收峰(如圖1)。

建立特異穩(wěn)定的多重核酸擴增體系是多重DHPLC分析方法重要的技術(shù)內(nèi)容。由于四種致病性分枝桿菌的核酸同源性高,其中結(jié)核分枝桿菌與牛分枝桿菌的基因組序列同源性高達99%〔14〕,而副結(jié)核分枝桿菌在分類上與禽分枝桿菌均屬禽分枝桿菌復(fù)合群,針對這四種分枝桿菌設(shè)計多重擴增引物并建立多重擴增體系難度較大。本研究在文獻檢索的基礎(chǔ)上,通過對多條基因序列的比對分析,篩選確定了每一種分枝桿菌的目標基因,并通過大量檢測試驗篩選出各菌種的特異引物并確定四重體系中的引物組合。在多重擴增體系反應(yīng)條件方面,通過檢測試驗篩選了具有高保真和熱啟動功能的DNA聚合酶,并通過梯度試驗確定了采用高退火溫度的擴增循環(huán)反應(yīng)條件,確保了擴增反應(yīng)特異高效。

DHPLC分析結(jié)果表明,四種分枝桿菌菌種均呈現(xiàn)獨特的DHPLC特征圖譜(圖1),每一菌種的標準株和分離株樣品均呈現(xiàn)穩(wěn)定的DHPLC峰圖(圖2),重現(xiàn)性好;對十幾種分枝桿菌的檢測結(jié)果顯示,不同菌種之間沒有出現(xiàn)交叉反應(yīng),表明所建立的PCR-DHPLC體系特異性好、穩(wěn)定可靠。臨床檢測試驗結(jié)果表明,多重PCR-DHPLC方法能快速檢測鑒定人或動物感染的結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌,檢出率高于細菌分離培養(yǎng)方法,而檢測周期小于1d,表明臨床適用性好。

本研究通過對多種分枝桿菌標準菌株和分離株樣品、常見微生物樣品、陽性模板克隆質(zhì)粒以及人與動物臨床樣品的檢測試驗,表明所建立的多重PCRDHPLC檢測分析技術(shù)能同時檢測鑒別四種重要致病性分枝桿菌,達到特異靈敏、快速高效的目的,可用于臨床快速檢測結(jié)核、副結(jié)核致病菌感染,也可用于對培養(yǎng)細菌進行菌種快速鑒定,適合在進出境檢驗檢疫、公共衛(wèi)生和動物疫病診斷和防控、流行病學(xué)調(diào)查研究等領(lǐng)域推廣應(yīng)用。

〔1〕劉志輝,羅春明,蔡杏姍.廣州市舊城區(qū)1994-2003年非結(jié)核分枝桿菌流行狀況分析〔J〕.中華流行病學(xué)雜志,2005,26(6):424.

〔2〕Jacinto RC,Gomes BP,Desai M,et al.Bacterial examination of endodontic infections by clonal analy sis in concert with denaturing high performance liquid chromatography〔J〕.Oral Microbiol Immunol,2007,22(6):403-10.

〔3〕Hurtle W,Shoemaker D,Henchal E,et al.Denaturing HPLC for identifying bacteria〔J〕.Biotechniques,2002,33(2):386.

〔4〕徐君怡,曹際娟,鄭秋月,等.變性高效液相色譜檢測食品中致瀉大腸桿菌〔J〕.微生物學(xué)報,2008,48(11):1526-1531.

〔5〕Nam YH,Lee SH,Ahn YC,et al.Detection of rifampin resistant mycobacterium tuberculosis complex using denaturing HPLC〔J〕.Korean J Lab Med,2008,28(2):95-102.

〔6〕Saram ki OR,Waltering KK,Visakorpi T.Methods for identifying and studying genetic alterations in hormone-dependent cancers〔J〕.Methods Mol Biol,2009;505:263-277.

〔7〕劉朝暉,王漢平,陳勁龍,等.運用變性高效液相色譜對肺炎克雷伯菌產(chǎn)ESBL進行基因分型〔J〕.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2005,25(9):764-767.

〔8〕陳茹,劉中勇,楊國海,等.結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌 Taq-Man?熒光PCR快速檢測方法的建立〔J〕.中國人獸共患病學(xué)報,2008,24(2):154-158.

〔9〕Hillemann D,Galle J,Vollmer E,et al.Real-time PCR assay for improved detection ofMycobacterium tuberculosiscomplex in paraffin-embedded tissues〔J〕.Int J Tuberc Lung Dis,2006,10(3):340.

〔10〕Tasara T,Stephan R.Development of an F57 sequence-based real-time PCR assay for detection ofMycobacteriumavium subsp.paratuberculosisin milk〔J〕.Appl Environ Microbiol,2005,71(10):5957-5968.

〔11〕 Yip CW,Leung K L,Wong D,et al.Denaturing HPLC for high-throughput screening of rifampicin-resistantMycobacterium tuberculosisisolates〔J〕.Int J Tuberc Lung Dis,2006,10(6):625.

〔12〕Shi R,Zhang J,Li C,et al.Detection of streptomycin resistance inMycobacterium tuberculosisclinical isolates from China as determined by denaturing HP LC analysis and DNA sequencing〔J〕.Microbes Infect,2007,9(14-15):1538-44.

〔13〕石瑞如,賈文斐,張國龍,等.DHPLC與SURVEYOR酶法在結(jié)核和牛分枝桿菌鑒別中的嘗試〔J〕.醫(yī)學(xué)研究雜志,2007,36(3):68-70.

〔14〕Sreevatsan S,Pan X,Stockbauer KE,et al.Restricted structural gene polymo rphism in theMycobacterium tuberculosiscomplex indicates evolutionarily recent global dissemination〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1997,94:9869-9874.

Establishment of the denaturing high-performance liquid chromatography combined with multiplex nucleic acid amplification method for rapid identification of four important pathogenic mycobacteria

CHEN Ru,BI Ying-zuo,LIU Zhi-ling,LIU Zhi-hui,MA Jing-yun,ZENG Bi-jian,WU Xiao-wei,ZHOU Ke,LIN Zhi-xiong

(Guangdong Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Guangzhou510635,China)

A new molecular method for simultaneously rapid detection and differentiation ofMycobacteriumtuberculosis,Mycobacterium bovis,Mycobacterium aviumandMycobacterium paratuberculosiswas established by using denaturing highperformance liquid chromatography(DHPLC)combined with multiplex nucleic acid amplification.These 4 important pathogenic mycobacteria were identified by separation of 4 specific PCR-amplified target fragments by DHPLC analysis.A total of 51Mycobacteriumstrains and 22 other bacterial species were tested to confirm the specificity of the multiplex PCR-DHPLC assay.The sensitivity of the assay was as low as 102-103gene copies.This method rapidly identify the positive clinical samples from human and bovine with higher detection ratio than traditional culture method and was able to identify simultaneously four pathogenicMycobacterium,which provided a new molecular tool for rapid detection of tuberculosis and paratuberculosis in human and animals.

denaturing high-performance liquid chromatography;Mycobacterium tuberculosis;Mycobacterium bovis;Mycobacterium avium;Mycobacterium paratuberculosis;multiplex PCR

R535

A

1002-2694(2010)01-0041-05

*國家質(zhì)檢總局科技項目(2006IK019)

1.廣東出入境檢驗檢疫局,廣州 510623;

2009-08-17;

2009-11-22