格林巴利綜合征相關(guān)及單純腹瀉相關(guān)空腸彎曲菌細胞毒作用分析*

孟凡亮,張茂俊,何利華,張建中

格林巴利綜合征相關(guān)及單純腹瀉相關(guān)空腸彎曲菌細胞毒作用分析*

孟凡亮,張茂俊,何利華,張建中

目的分析格林-巴利綜合征(GBS)相關(guān)空腸彎曲菌細胞毒素(CDT)作用。方法9株GBS相關(guān)空腸彎曲菌以及4株腹瀉患者分離菌株的全菌蛋白分別以0.001 μ g～ 5μ g/mL的濃度作用于HeLa細胞,通過觀察細胞形態(tài)的改變,獲得不同菌株對細胞作用的差異。結(jié)果不同菌株間產(chǎn)生細胞毒作用的濃度范圍從0.01μ g/mL到5μ g/mL。結(jié)論GBS相關(guān)菌株對HeLa細胞的細胞毒素作用與腹瀉患者分離株相比沒有顯著差異。不同空腸彎曲菌菌株對HeLa細胞的細胞毒素作用具有菌株特異性。

空腸彎曲菌;細胞毒素;HeLa細胞

空腸彎曲菌(Campy lobacter jejuni,C.jejuni)是主要導(dǎo)致人類腹瀉的彎曲菌屬的一個種〔1〕?？漳c彎曲菌感染導(dǎo)致的人類疾病稱為空腸彎曲菌病,世界衛(wèi)生組織(WHO)將空腸彎曲菌病列為27種新發(fā)傳染病之一。空腸彎曲菌病的主要癥狀是腹瀉性腸炎。除腸炎外,空腸彎曲菌的感染與GBS密切相關(guān),是導(dǎo)致GBS的主要病因之一〔2〕,感染了GBS相關(guān)的空腸彎曲菌,疾病負擔(dān)增加。細菌的細胞毒性作用與細菌的致病力密切相關(guān),研究發(fā)現(xiàn)空腸彎曲菌菌株的細胞毒素作用與菌株感染后導(dǎo)致的臨床結(jié)果有關(guān),細胞毒素作用強的菌株導(dǎo)致的臨床癥狀明顯嚴重〔3-4〕。為進一步了解空腸彎曲菌尤其是GBS相關(guān)的空腸彎曲菌的細胞毒素作用特征,本研究利用細菌細胞相互作用模式,對9株背景資料清晰的格林-巴利綜合征相關(guān)空腸彎曲菌菌株以及4株腹瀉相關(guān)菌株作用于Hela細胞,通過Hela細胞的形態(tài)變化特點,初步分析了13株空腸彎曲菌對細胞的相關(guān)毒素作用。

1 材料與方法

1.1 材料 細菌:本科室保存的13株空腸彎曲菌(9株從GBS病人分離,4株從腹瀉病人分離,菌株的背景及相關(guān)生物特征見表1)。以菌株81-176作為陽性對照、幽門螺桿菌J99為陰性對照。細胞:HeLa細胞,由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所腹瀉病研究室贈。空腸彎曲菌培養(yǎng)液:細菌培養(yǎng)基為哥倫比亞瓊脂(OXOID M0331),細胞培養(yǎng)基為RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO)、胎牛血清(GIBCO)、Trypsin-EDTA(GIBCO)。

表1 空腸彎曲菌菌株背景及對HeLa細胞的最小作用濃度Table 1 Background of C.jejuni strains and minimum concentration on HeLa cells

1.2 方法

1.2.1 細菌培養(yǎng) 復(fù)活保存的空腸彎曲菌,取單菌落菌株轉(zhuǎn)種于含10%羊血的哥倫比亞瓊脂,微需氧條件(5%O2,10%CO2,85%N2)37℃培養(yǎng)24h。

1.2.2 全菌裂解液收集 收集細菌,用PBS(pH 7.4)洗2遍(4 000g離心,4℃,5min),將沉淀菌體重懸于2 mL PBS中超聲破碎(4s×10),12 000 r/min離心 10min,上清用0.22μ m 除菌過濾。BCA法檢測蛋白濃度后分裝,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 HeLa細胞的培養(yǎng) 復(fù)蘇HeLa細胞,用10%FBS-1640培養(yǎng)基,置于二氧化碳孵箱,37℃培養(yǎng)2～3d后,用Trypsin-EDTA消化后轉(zhuǎn)到24孔細胞培養(yǎng)板,2×104cells/孔,培養(yǎng)24 h,細胞毒素作用前2h換為1.5%FBS-1640培養(yǎng)基。

1.2.4 全菌蛋白細胞毒性檢測 分別將5μ g/mL、1μ g/mL 、0.1μ g/mL 、0.01μ g/mL 和 0.001μ g/mL不同濃度的細菌全菌蛋白裂解液與HeLa細胞共同培養(yǎng),連續(xù)觀察細胞形態(tài)改變(細胞發(fā)生腫脹,變大,形狀變得不規(guī)則,最后破裂)。當(dāng)50%以上的細胞形態(tài)發(fā)生改變時,確定為該菌蛋白的最小作用濃度。比較不同菌株最低作用濃度的差異(μ g/mL),PBS作為空白對照。

2 結(jié) 果

空腸彎曲菌全菌蛋白作用于HeLa細胞后,細胞發(fā)生腫脹、變大、形狀變得不規(guī)則、最后破裂(圖1)。不同濃度的細菌裂解液作用于HeLa細胞,細胞形態(tài)變化不同,相同菌株隨著蛋白濃度的增加,細胞變化強度增加。不同菌株作用于HeLa細胞后導(dǎo)致細胞形態(tài)發(fā)生變化的的最小作用濃度(50%以上細胞形態(tài)發(fā)生改變)不同(表1)。實驗結(jié)果顯示CJGBLC株空腸彎曲菌細胞毒性較弱,濃度為5 μ g/mL時,對HeLa細胞未產(chǎn)生明顯的細胞毒性作用(圖1-D);陽性對照株81-176在濃度為0.01 μ g/mL時仍對HeLa細胞產(chǎn)生細胞毒性作用(圖1-C);陰性對照幽門螺桿菌 J99在濃度為 5 μ g/mL時對HeLa細胞無明顯細胞毒性作用。

3 討 論

圖1 空腸彎曲菌全菌蛋白作用于HeLa細胞后,細胞形態(tài)變化(圖片用Olympus BX51顯微鏡拍攝,100×)Fig.1 Morphologic change of HeLa celles after treated with whole cell lysis of C.jejuni strains

西方發(fā)達國家中,空腸彎曲菌的感染位于食源性感染的首位,是主要的食品安全監(jiān)測病原。我國自上世紀(jì)80年代第一次分離出空腸彎曲菌后,全國各地都有關(guān)于空腸彎曲菌的報導(dǎo)。隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展和國民生活模式的改變,我國空腸彎曲菌的感染也越來越受到國家疾病預(yù)防控制工作的重視?？漳c彎曲菌感染后導(dǎo)致的臨床癥狀是腹瀉性腸炎,同時患者伴有發(fā)熱,頭疼,腹痛,惡心,嘔吐等癥狀?？漳c彎曲菌腸炎分為輕、中、重型。空腸彎曲菌的致病機制不是很清楚,但菌株的脂多糖成分,菌株的黏附定植能力以及菌株的活動力等皆與菌株的致病機制相關(guān)。目前研究發(fā)現(xiàn)空腸彎曲菌感染后導(dǎo)致的臨床表現(xiàn)與菌株的細胞毒性有關(guān)。細胞溶漲毒素CDT(cytolethal distending toxin,簡稱 CDT)〔5-6〕是目前研究證明空腸彎曲菌的唯一細胞毒素,本次研究應(yīng)用CDT基因皆為陽性,血清型不同的,來源于GBS患者的9株空腸彎曲菌和來源于腹瀉病患者的4株空腸彎曲菌,比較了其對HeLa細胞的細胞毒素作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同菌株細胞毒作用的最低作用濃度有顯著差異。菌株81-176的細胞毒作用最強,最小作用濃度為0.01 μ g/mL。13株空腸彎曲菌中,10株的最小作用濃度相同,皆為 0.1 μ g/mL。其中菌株CJ-GBLC的最小作用濃度最高,是其它菌株的50倍多,表明其細胞毒素作用遠遠小于其它菌株。與對照陽性菌株81-176相比,空腸彎曲菌菌株間細胞毒性作用可以相差500倍。

本次研究結(jié)果表明,空腸彎曲菌的細胞毒作用與菌株的血清型沒有顯著的相關(guān)性。GBS相關(guān)菌株與普通腹瀉相關(guān)菌株比,其細胞毒素作用沒有顯著差異。即使菌株CDT基因陽性,空腸彎曲菌不同菌株的細胞毒作用可以相差較大。是不同菌株CDT的含量或毒性差異,還是除CDT外,空腸彎曲菌存在其它細胞毒素決定因子,有待進一步分析。

〔1〕M oore JE,Corcoran D,Dooley JS,et al.Campylobacter〔J〕.Vet Res,2005,36(3):351-382.

〔2〕張茂俊,張建中.空腸彎曲菌病與格林巴利綜合征〔J〕.中華流行病學(xué)雜志,2008,29(6):618-621.

〔3〕Bang D D,Schuetsz F,Ahrens P,et al.Prevalence of cytolethal distending toxin(CDT)genes and CDT production in Campylobacter SPP isolated from Danish broilers〔J〕.Journal of medical microbiology,2001,50(12):1087-1094.

〔4〕Yamano R,Ohara M.Prevalence of cytolethal distending toxin production in periodontopathogenic Bacteria〔J〕.Journal of Clinical Microbiology,2003,41(4):1391-1398.

〔5〕Coote J G,Stewart-tull D E,Owen R J,et al.Comparison of virulence-associated in vitro properties of typed strains of campylobacter jejuni from different sources〔J〕.J Med Microbile,2007,56:722-732.

〔6〕謝龍山,蔡方成.Penner 19空腸彎曲菌毒素的細胞毒性作用研究〔J〕.中華兒科雜志,2002,40(5):283-287.

Cytotoxic effect of Guillain-Barre syndrome-associated and diarrhea-associatedCampylobacter jejuni

MENG Fan-liang,ZHANG Mao-jun,HE Li-hua,ZHANG Jian-zhong

(National Institute of Communicable Disease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention,Beijing102206,China)

In order to assess the cytotoxin effect ofCampylobacter jejuni(C.jejuni),the whole cell lysates from 9 strains of Guillan-Barre Syndrome(GBS)-associatedC.jejuniand 4 strains of diarrhea-associatedC.jejuniwere co-cultivated with HeLa cells at the concentration of 0.001-5.00μ g/mLin vitro.The morphologic change of HeLa cells was observed under Olympus BX51 microscope after treatment with different concentration of bacteria lysate in the following 4 days.The morphological changes including swelling,irregularity and lysis of the affected cells over 50%was selected as the cut off for positive change andC.jejuni81-176 andHelicobacterJ99 strains were chosen as the positive and negative control.It was found that the minimum concentration to induce the positive changes in 10 strains(8 GBS associated and 2 strains from diarrhea patients)was 0.1μ g/mL and 1 strain with the positive change at the minimum concentration of 1 μ g/mL.There was only one GBS-associated strain causing no morphologic change on HeLa cells at the concentration of 5μ g/mL.It was evident that the cytotoxic effect ofC.jejunistrains on HeLa cell was strain-specific,and there was no significant difference in the cytotoxic effect on HeLa cell between GBS-associated and diarrhea associatedC.jejunistrains.

Campylobacter jejuni;cytotoxic effect;HeLa cell

R331

A

1002-2694(2010)01-0010-03

*十一五國家科技支撐計劃課題(2006BAK02A15-2)

張建中,Email:zhangjianzhong@icdc.cn

中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所,北京102206

2009-06-11;

2009-10-09