定量PCR研究細粒棘球蚴抗氧化相關(guān)基因的差異表達*

侯秋蓮,張富春,張文寶,吾拉木?馬木提,張壯志

2.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院新疆生物資源基因工程重點實驗室,烏魯木齊 830046;

3.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所,烏魯木齊 830000

定量PCR研究細粒棘球蚴抗氧化相關(guān)基因的差異表達*

侯秋蓮1,張富春2,張文寶3,吾拉木?馬木提1,張壯志3

目的在已構(gòu)建的氧化脅迫下細粒棘球蚴(Echinococcus granulosus)與正常組織差異表達的消減cDNA文庫中,篩選細粒棘球蚴在抗氧化過程中差異表達的重要基因。方法將前期研究中應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)(suppression subtractive hybridization,SSH)構(gòu)建氧化脅迫下細粒棘球蚴差異表達基因的消減cDNA文庫進行藍白斑篩選和菌落PCR分析后測序分析。測序結(jié)果利用BLAST在線軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫進行同源序列比對分析和BlastX分析。從文庫中隨機挑選4個未知新序列和抗氧化密切相關(guān)的TPx基因片段,利用定量PCR法研究氧化脅迫下,差異表達基因片段在mRNA水平上的變化情況。結(jié)果整個文庫克隆測序結(jié)果獲得重要基因的cDNA序列,如氧化還原酶、蛋白激酶、生長因子等。另有部分克隆在GenBank中無法查到對應(yīng)的同源基因,可能代表了新基因。定量PCR結(jié)果顯示:S88、H32-1兩個基因在0.8 mmol/L H2O2氧化脅迫的原頭蚴中表達量分別上調(diào)為未經(jīng)氧化脅迫原頭蚴中的2.0和2.3倍,TPx基因片段當(dāng)H2O2濃度大于0.8 mmol/L時,其表達量增高。結(jié)論上述基因的上調(diào)表達很可能與細粒棘球蚴在抗氧化過程中的相關(guān)功能有密切的聯(lián)系,可以作為研究細粒棘球蚴抗氧化的候選基因。

細粒棘球蚴;氧化脅迫;抑制性消減雜交;熒光定量PCR;基因差異表達

2.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院新疆生物資源基因工程重點實驗室,烏魯木齊 830046;

3.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所,烏魯木齊 830000

細粒棘球蚴(Echinococcus granulosus)是囊性包蟲病的病原體,棘球蚴以包囊形式在人和其它中間宿主的內(nèi)臟器官中生長,在其早期發(fā)育階段,包囊自身和宿主的新陳代謝及對感染產(chǎn)生的免疫應(yīng)答都會產(chǎn)生大量的不穩(wěn)定的活性氧類物質(zhì)(reactive oxygen species,ROS),ROS具有很高的反應(yīng)性,能夠?qū)Φ鞍?、膜脂和DNA造成直接的損傷,產(chǎn)生嚴(yán)重的生物學(xué)效應(yīng),當(dāng)在機體內(nèi)大量堆積時可導(dǎo)致細胞、組織的死亡〔1-2〕。1998 年,Salinas等〔3〕發(fā)現(xiàn):在體外培養(yǎng)條件下,細粒棘球蚴的幼蟲原頭蚴(PSC)階段可以代謝H2O2,而在其體內(nèi)檢測不到過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性,因此推測細粒棘球蚴體內(nèi)存在其它的抗氧化基因,保護機體免受氧化損傷過程中起著關(guān)鍵的作用,其對于棘球蚴在人和其它中間宿主內(nèi)臟器官中存活是十分必要的。

在前期研究中〔4〕,構(gòu)建了氧化脅迫下細粒棘球蚴與正常組織差異表達的消減cDNA文庫,本研究應(yīng)用real-time PCR技術(shù),進一步對細粒棘球蚴在氧化脅迫下基因的mRNA水平差異表達進行研究,探究細粒棘球蚴在氧化誘導(dǎo)過程中相關(guān)靶基因的表達變化及其功能。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 標(biāo)本來源 從新疆烏魯木齊市屠宰場新鮮采集自然感染細粒棘球蚴的綿羊肝臟,立即帶回實驗室,清潔臟器表面。在無菌條件下,用吸管吸取原頭蚴,將其置于含有青鏈霉素的無菌PBS液中(pH 7.3),洗3次,離心后將沉淀加入1%pepsin(pH 3.0)中,于37℃消化30 min后,用吸管反復(fù)抽吸以破壞囊膜,使原頭蚴從育囊中散出,同時用無菌PBS液漂洗3次除去育囊碎片,倒置顯微鏡下檢查其活性,用含有10%牛血清的DMEM培養(yǎng)基無菌培養(yǎng)于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱。培養(yǎng)24 h的原頭蚴用于實驗。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基(High Glucose)購自美國Gibco公司;T rizol試劑購自美國Invitrogen公司;標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清FBS 、T4DNA 連接酶 、pMD18-T 載體 、DNA Marker、X-Gal、ExTaqDNA聚合酶均購自大連寶生物工程有限公司;PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自北京百泰克生物公司;DH5α大腸桿菌為本室保存;DNaseⅠ、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagentKit(TaKaRaCode:DRR037S)、熒光定量 PCR 試劑盒 SYBR○RPremix Ex TaqTM(Perfect Real Time)(TaKaRa Code:DRR041S)購自 TaKaRa公司;熒光定量PCR采用德國 Roche公司的 Lightcycler 1.5型熒光定量PCR儀,以及該公司生產(chǎn)的Real time PCR專用加樣毛細管;其他試劑為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 消減cDNA文庫構(gòu)建 見文獻4。

1.2.2 消減cDNA文庫的鑒定、測序與序列分析各取SSH文庫中1μ L菌液作為PCR擴增模板,以pMD18-T載體多克隆位點兩端通用引物進行菌落PCR擴增,證明含有插入片段后(200-1 000 bp),將整個文庫送天根生化科技(北京)有限公司進行測序。將測序結(jié)果去除載體和引物序列以后,利用BLAST在線軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫進行同源序列比對分析和BlastX分析。

1.2.3 差異表達基因的實時熒光定量PCR 根據(jù)測序分析結(jié)果,從文庫中隨機挑選4個未知新序列和抗氧化密切相關(guān)的TPx基因片段,設(shè)計定量PCR引物(表1),以ActinⅠ基因為參照標(biāo)準(zhǔn)進行定量分析。原頭蚴進行不同H2O2濃度(0,0.8,1.6,2.4 mmol/L)的氧化脅迫處理24 h,總RNA的抽提采用 Trlzol試劑,用 RNase Free DNaseⅠ處理總RNA,以除去總RNA的DNA。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 采用TaKaRa公司的Prime-ScriptTMRT reagent Kit。反應(yīng)體系為:模板2 μ L,5×PrimeScript緩沖液4 μ L,PrimeScript酶混合物1 μ L,Oligo dT 和 Random 6 mers 引物各 1 μ L,加RNase Free dH2O至總體系為20μ L。

1.2.5 Real time PCR反應(yīng) 取相同量的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR反應(yīng),real-time PCR反應(yīng)采用TaKaRa公司的SYBR?Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time),按照說明書在冰上配制PCR反應(yīng)液,每個樣品重復(fù)3次。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn) real-time PCR反應(yīng)的擴增曲線和融解曲線。

表1 定量RT-PCR所用的基因特異性引物Table 1 Gene specific primers for quantitative RT-PCR

1.3 定量PCR數(shù)據(jù)處理 利用實時定量PCR分析基因在不同組織中的表達差異,目前常用的是相對定量法 ,多采用 2–ΔΔCt法〔5〕,確定特定熒光域值對應(yīng)循環(huán)數(shù)的Ct值,對目標(biāo)基因定量。

2 結(jié) 果

2.1 cDNA測序與序列分析初步結(jié)果 將消減cDNA文庫送至北京天根公司,進行全文庫單向測序掃描。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫,將測序結(jié)果進行同源序列比對和BlastX分析,部分結(jié)果列于表2中。發(fā)現(xiàn)文庫中有7個EST s序列在數(shù)據(jù)庫中找不到同源片段,這7個EST可能代表了新基因。另有部分基因功能與氧化還原關(guān)系密切,如SSH-18、SSH-90等。

表2 部分陽性克隆BlastX分析結(jié)果Table 2 BlastXanalysis of the partialy clones

2.2 差異表達基因的實時熒光定量PCR分析 為了更準(zhǔn)確地鑒定SSH文庫中差異表達基因的可靠性,采用實時熒光定量PCR分析了5個EST在原頭蚴經(jīng)H2O2氧化脅迫處理和未處理對照中的差異表達情況,其中TPx為抗氧化基因家族中的一員,其余為功能未知基因。圖1是對這些差異表達基因3個重復(fù)樣品的解鏈曲線分析。從圖中可以看出,隨著溫度的升高,與雙鏈DNA結(jié)合的熒光染料SYBR GreenⅠ逐漸被釋放,曲線均無雜峰出現(xiàn),說明實驗過程中無樣品污染和引物二聚體,擴增產(chǎn)物單一,確定為特定的片段。

圖1 部分差異表達EST的融解曲線分析Fig.1 Melting curve analysis of differential expressed ESTs A:Differential expressed EST of TPx;B:Differential expressed EST of S88 and H32-1;C:Differential expressed EST of O68 and D12.

2.3 差異表達基因的數(shù)據(jù)整理 目標(biāo)基因與內(nèi)對照基因(ActinⅠ)Ct值的差值(△Ct)列于表3、表4中。S88、H32-1兩個基因在0.8 mmol/L H2O2氧化脅迫的原頭蚴中表達量分別達到了未經(jīng)氧化脅迫原頭蚴中的2.0和 2.3倍,在2.4 mmol/L H2O2氧化脅迫的原頭蚴中,這兩個基因的表達量分別達到了未經(jīng)氧化脅迫原頭蚴中的8.0和6.1倍。

表3 S88基因相對表達分析Table 3 The fold change in expression of the S88 gene relativeto the internal control gene(ActinⅠ)

表4 H32-1基因相對表達分析Table 4 The fold change in expression of the H32-1 gene relative to the internal control gene(ActinⅠ)

3 討 論

逆境壓力會刺激細胞產(chǎn)生氧化自由基,過量的氧化自由基卻會導(dǎo)致細胞走向凋亡〔6〕。當(dāng)機體處于應(yīng)激條件時,體內(nèi)ROS產(chǎn)生增加,體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)作用增強〔7〕。

基因的表達量基因定量過氧化氫作為細胞內(nèi)信號分子,它可以與信號通路中蛋白質(zhì)的巰基反應(yīng),使之活化或失活,參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在哺乳類動物,胞間氧化還原狀態(tài)與細胞分化、免疫應(yīng)答、生長控制、腫瘤發(fā)生和細胞凋亡都有著密切聯(lián)系〔8-9〕。囊型包蟲病呈世界性分布,其流行已成為全球性的公共衛(wèi)生問題〔10-11〕。寄生蟲通過合成抗氧化酶并大多在宿主—寄生蟲的接觸面表達以適應(yīng)及抵抗氧化脅迫的壓力〔12-13〕?？寡趸冈诒Ｗo寄生蟲抵御來自宿主新陳代謝和白細胞激活的ROS的氧化損傷起關(guān)鍵作用〔14〕,提示細粒棘球蚴具有抵抗氧化的機制。

在前期研究中〔4〕,對SSH技術(shù)在寄生蟲研究領(lǐng)域的應(yīng)用進行了嘗試,構(gòu)建了H2O2脅迫PSC與正常組織差異表達的消減cDNA文庫。本研究進一步對實驗分離克隆到一些重要基因的cDNA序列進行分析,這些基因編碼的產(chǎn)物功能可以大致分為兩類:第一類是功能蛋白類,在細胞內(nèi)可直接發(fā)揮保護功能,如氧化還原酶。第二類是調(diào)控蛋白類,在各種脅迫反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或基因表達中起調(diào)節(jié)作用,間接起保護作用,如蛋白激酶、生長因子等。蛋白激酶在脅迫信號感應(yīng)和轉(zhuǎn)導(dǎo)中有重要作用〔15〕。另有部分克隆在GenBank中無法查到對應(yīng)的同源基因,這些可能代表了新基因。

Real-time PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),本研究所構(gòu)建的 SSH 文庫中 ,S88、H32-1 、TPx 、D12、O68 、I36、P72、I39、F21、H32-2 基因都是受 H2O2誘導(dǎo)的,而且隨著H2O2濃度不同,其表達量也有變化。當(dāng)H2 O2濃度為2.4 mmol/L時,表達量為最高,說明隨著H2O2濃度的升高,該部分基因的表達可以持續(xù)增強。其中,S88、H32-1基因的表達變化量分別為未經(jīng)H2O2處理對照的8.0倍和6.1倍。由此說明所構(gòu)建的SSH文庫有效地富集了原頭蚴經(jīng)氧化脅迫特異表達的基因,可以進一步通過反向雜交手段篩選影響原頭蚴抗氧化功能的主效基因。推測,S88和H32-1等幾個新EST表達量的提高與原頭蚴的抗氧化功能密切相關(guān),可以進一步把它們作為原頭蚴抗氧化的候選基因來進行更深層次功能的研究。而對于TPx基因表達變化差異,在經(jīng)過H2O2濃度為0.8 mmol/L處理時,其表達量表現(xiàn)有下降,當(dāng)H2O2濃度增高大于0.8 mmol/L時,其表達量又增高。Real-time PCR檢測TPx表達量在經(jīng)過H2O2濃度為0.8 mmol/L處理后和對照組表達差異不大,其原因如何,還需要進一步探討。

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The differential expression of the anti-oxidation related genes inEchinococcus granulosusby real-time PCR

HOU Qiu-lian,ZHANG Fu-chun,ZHANG Wen-bao,MAMUTI Wulamu,ZHNAG Zhuang-zhi
(Basic Medicine College of Xinjiang Medical University,Urumqi830054,China)

To isolate the specific genes in protoscoleses(PSC)ofEchinococcusgranulosusunder oxidative stresses from the SSH library constructed in the previous study,the gene expression in PSC under oxidative stresses was studied by using real-time PCR.The previously amplified library was sequenced and analyzed in GenBank with Blast research.Sequence analysis indicated that all clones in the SSH library contained the coding sequences,of which some clones showed homology in the Gen-Bank and others were unknown.Differential expression of 4 genes randomly selected and the TPx gene in this library were studied with real-time PCR.It was demonstrated that the gene expression of S88 and H32-1 in oxidative tissues was 2.0 and 2.3 times higher than the un-oxidative stresses respectively.The TPx gene was up-regulated when PSC was induced with H2H2of more than 0.8 mmol/L.These results implies that the up-regulated expression of the above-mentioned genes may be related with the related functions of anti-oxidative process in PSC and they may be used as the candidate genes for the study of anti-oxidation ofE.granulosus.

Echinococcusgranulosus;oxidative stress;suppression subtractive hybridization;real-time PCR;dfferentially expressed gene

R383.33

A

1002-2694(2010)01-0001-05

*美國國立衛(wèi)生研究院 R03基金資助項目(No.R03AI063367-01),國家自然科學(xué)基金項目(30760229),新疆教育廳創(chuàng)新群體資助項目(No.XJEDU2004G02)

吾拉木?馬木提,Email:mwulamu@hotmail.com

1.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原學(xué)教研室,烏魯木齊830054;

2009-04-30;

2009-11-22