不同時間去勢對大鼠CIA發(fā)病情況的影響

鞠大宏，趙宏艷，王 燕，肖 誠，查青林，張繼東，董鑫鑫呂 誠，劉梅潔，李 艷，劉 紅，于 崢，潘貴超，呂愛平

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700;2.中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所，北京 100029;3.江西中醫(yī)學(xué)院，江西南昌 330004;4.天津骨科醫(yī)院，天津 300211;5.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100700;6.北京市昌平區(qū)華一醫(yī)院，北京 102208)

目前類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)動物模型主要采用Ⅱ型膠原免疫誘導(dǎo)進(jìn)行制作，隨著人們對RA和膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collageninduced arthritis，CIA)的深入研究，發(fā)現(xiàn)二者存在許多類似之處［1～8］，是目前公認(rèn)的RA最佳動物模型。從中醫(yī)角度來看，該模型缺乏中醫(yī)證候?qū)傩浴Ｖ嗅t(yī)理論認(rèn)為，腎虛在痹證(RA)發(fā)病中起著重要作用，據(jù)此本實(shí)驗(yàn)擬在去勢的基礎(chǔ)上，用CⅡ進(jìn)行免疫來制作腎虛痹證(RA)病證結(jié)合動物模型。主要觀察不同程度的腎虛狀態(tài)對大鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)病情況的影響，以及尋找出在去勢后的那個時間點(diǎn)進(jìn)行CⅡ免疫誘導(dǎo)能夠制作出發(fā)病率高和發(fā)病程度重的動物模型，以期為腎虛痹證(RA)病證結(jié)合動物模型的制作提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選用6周齡SPF級SD大鼠100只，雌雄各半，由中國藥品生物制品檢定所提供，動物許可證號SCXK(京)2005-0004。在中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所清潔級動物室喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動物室許可證號SYXK(京)2005-0024。

1.1.2 主要試劑與儀器 主要試劑:牛Ⅱ型膠原(CⅡ)、不完全弗氏佐劑(IFA):美國Chondrex公司產(chǎn)品，批號080217;戊巴比妥鈉:北京化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，批號020427;大鼠IL-6 ELISA試劑盒:美國 Bender公司產(chǎn)品，批號 BMS625;大鼠 IL-10ELISA試劑盒:美國 Bender公司產(chǎn)品，批號BMS629;大鼠皮質(zhì)酮(Corticosterone，CORT)ELISA試劑盒:德國DRG公司產(chǎn)品，批號EIA-4164;大鼠抗Ⅱ型膠原ELISA試劑盒:美國Chondrex公司產(chǎn)品，批號2042。

主要儀器:Leica QwinV3圖像分析系統(tǒng)，德國Leica公司產(chǎn)品;AS325型切片機(jī):英國SHONDON公司產(chǎn)品;T10 BASIC手持式分散機(jī):德國IKA公司產(chǎn)品;Multiskan Mk3酶標(biāo)儀、Wellwash 4 Mk2洗板機(jī):美國Thermo公司。

2 方法

2.1 動物分組及處理

將動物隨機(jī)分為對照CIA組、去勢1周CIA組、去勢2周 CIA組、去勢3周 CIA組、去勢4周CIA組5組，每組20只(雌雄各半)。為了保證CⅡ免疫條件的齊同性，各組均在同一時間免疫，以免疫時間為基準(zhǔn)點(diǎn)，在免疫前1周行去勢手術(shù)的即為去勢1周CIA組，去勢2周CIA組、去勢3周CIA組、去勢4周CIA組則以此類推。免疫后每7 d稱重1次。

按常規(guī)方法［9］切除大鼠的雙側(cè)睪丸或卵巢。CⅡ免疫的具體方法:取適量Ⅱ型膠原溶液(濃度為2mg/ml)逐滴加入至等容積的不完全弗氏佐劑中，Ⅱ型膠原終濃度為1mg/ml。冰浴中用勻漿器充分乳化，以滴加水中不擴(kuò)散為度，取乳化后的混合物按0.2ml/只，即200μg CⅡ/只于尾根部皮下注射。7d后按0.1ml/只，即100μg CⅡ/只，于尾根部皮下加強(qiáng)免疫1次。

2.2 取材

于免疫后第35天戊巴比妥鈉麻醉下，采用腹主動脈取血，2500 r/min，20 min離心后取血漿，分裝后－80℃冰凍備用。開腹立即取出胸腺、脾臟和腎上腺并稱重。每只大鼠的胸腺、脾臟和及腎上腺(mg)分別與對應(yīng)大鼠體重(g)的比值為胸腺系數(shù)、脾臟系數(shù)及腎上腺系數(shù)。取雙側(cè)膝、踝關(guān)節(jié)，在福爾馬林中固定備用。

2.3 指標(biāo)的測定

2.3.1 一般狀態(tài)觀察 觀察大鼠一般狀態(tài)的改變:精神狀況，如是否有委靡、嗜睡、蜷縮、扎堆，對聲音、觸動刺激反應(yīng)遲鈍以及毛松消瘦、失去光澤等。

2.3.2 關(guān)節(jié)炎指數(shù)(Arthritis index，AI)評分方法 造模后開始觀察并記錄關(guān)節(jié)病變程度，每7d 1次。參照5級評分法評價［10、11］，將2只后踝關(guān)節(jié)的病變程度累計積分，計算出關(guān)節(jié)炎指數(shù)，每個動物最大為8分。

0分:無關(guān)節(jié)炎;1分:小趾關(guān)節(jié)輕度腫脹;2分:小趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹;3分:踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹;4分:包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)全部關(guān)節(jié)腫脹。

2.3.3 關(guān)節(jié)切片及光鏡下關(guān)節(jié)破壞半定量分析方法 關(guān)節(jié)在福爾馬林固定1周后，5%HNO3脫鈣1周，酒精逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包理，切片，常規(guī)HE染色。光鏡下觀察滑膜、軟骨、骨的病理改變，并進(jìn)行關(guān)節(jié)病理損傷半定量分析［12］。

0分:關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)正常，關(guān)節(jié)間隙均勻，軟骨、骨無損傷，滑膜組織無炎癥、增生等;1分:關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)基本正常，有滑膜增生，血管數(shù)量增加，可見少量炎細(xì)胞浸潤，軟骨表層輕度破壞;2分:關(guān)節(jié)軟骨有明顯的侵蝕破壞，血管翳形成，炎細(xì)胞浸潤明顯，無骨破壞，關(guān)節(jié)間隙基本正常;3分:有大量的血管翳形成，可見廣泛的軟骨的侵蝕破壞，可見骨破壞，關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)遭破壞。

2.3.4 血漿CORT、抗Ⅱ型膠原抗體、IL-6、IL-10的檢測 采用ELISA方法，按照所附說明書測定血漿中CORT、抗Ⅱ型膠原抗體、IL-6、IL-10含量。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 CⅡ免疫誘導(dǎo)對不同時間去勢大鼠脾臟、胸腺及腎上腺系數(shù)的影響

表1、2顯示，胸腺系數(shù):與對照CIA組相比，去勢1周、2周、3周CIA組大鼠胸腺系數(shù)明顯升高(P<0.05，0.01)，去勢4周 CIA組與對照 CIA組相比，無顯著性差異。脾臟系數(shù):去勢1周、2周CIA雌性大鼠脾臟系數(shù)與對照CIA組相比明顯升高(P<0.05)，去勢2周CIA雄性大鼠脾臟系數(shù)與對照CIA組相亦比明顯升高(P<0.05)，其余各組與對照CIA組相比，無顯著性差異。腎上腺系數(shù):去勢3周雄性大鼠與對照CIA組大鼠相比，腎上腺系數(shù)明顯增高(P<0.05);其余各組與對照CIA組相比，無顯著性差異。

表1 各組雌性大鼠脾臟、胸腺及腎上腺系數(shù)的變化(mg/g)

表2 各組雄性大鼠脾臟、胸腺及腎上腺系數(shù)的變化(mg/g)

3.2 CⅡ免疫誘導(dǎo)對不同時間去勢大鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)病率的影響

對不同去勢時間關(guān)節(jié)炎發(fā)病情況數(shù)據(jù)進(jìn)行動態(tài)分析，發(fā)現(xiàn)對照CIA組大鼠與CIA去勢組大鼠，或者不同去勢時間CIA大鼠發(fā)病率影響沒有顯著性差異(P=0.9159)。

表3 CⅡ免疫誘導(dǎo)的SD大鼠對不同時間去勢關(guān)節(jié)炎發(fā)病情況邊際數(shù)比較

大鼠從14d開始發(fā)病然后一直持續(xù)到觀察結(jié)束仍然處于疾病狀態(tài)則視為有效發(fā)病，不同去勢時間有效發(fā)病率見表4。

表4 不同時間去勢造模大鼠有效發(fā)病率情況

3.3 CⅡ免疫誘導(dǎo)對不同時間去勢大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的比較

圖1 不同時間去勢CIA模型關(guān)節(jié)炎指數(shù)隨時間變化曲線圖

3.4 CⅡ免疫誘導(dǎo)對不同時間去勢大鼠膝、踝關(guān)節(jié)病理積分的影響

光鏡下觀察結(jié)果顯示，各組膝、踝關(guān)節(jié)可見明顯的滑膜細(xì)胞增生，排列紊亂，滑膜組織充血水腫，毛細(xì)血管增生，并可見炎細(xì)胞浸潤;增生的滑膜組織形成絨毛狀，可伸向關(guān)節(jié)腔深處，或向軟骨面爬行形成血管翳。在血管翳覆蓋下的軟骨表層可見明顯的軟骨表層組織的變性、壞死。關(guān)節(jié)軟骨面剝脫，可見關(guān)節(jié)腔內(nèi)有脫剝的關(guān)節(jié)軟骨及滑膜組織。

3.5 CⅡ免疫誘導(dǎo)對不同時間去勢大鼠血漿中CORT含量的影響

雙因素方差分析統(tǒng)計結(jié)果顯示，性別對CORT影響有顯著性(P<0.0001)。數(shù)據(jù)顯示，性別和分組之間有交互作用(P<0.05)，所以按性別做分層分析可以了解不同性別分組之間的差異。結(jié)果顯示，去勢后不同性別大鼠對CORT的反應(yīng)變化相反，即與未去勢CIA組比較，雌性去勢CIA組大鼠血漿CORT水平明顯降低(P<0.01，P<0.05)，除去勢1周組外，雄性大鼠CORT均顯著升高(P<0.01，P<0.05)，且與去勢時間呈正相關(guān)，大鼠去勢3周血漿CORT與去勢4周相比，無顯著性差異。

圖2 不同時間去勢關(guān)節(jié)病理積分比較圖

3.6 CⅡ免疫誘導(dǎo)對不同時間去勢大鼠血漿中抗CⅡ抗體含量的影響

圖3 不同時間去勢CIA大鼠血漿CORT變化

圖4 不同時間去勢CIA大鼠血漿抗CⅡ抗體變化

雙因素方差分析統(tǒng)計顯示性別對抗Ⅱ型膠原抗體影響無顯著性(P=0.384)，去勢時間對抗Ⅱ型膠原抗體影響有顯著性差異(P<0.0001)，LSD法兩兩比較顯示，隨著去勢時間增加，抗Ⅱ型膠原抗體明顯升高，與對照CIA組比較，去勢2、3、4周 CIA組大鼠血清抗Ⅱ型膠原抗體水平明顯升高(P<0.05)，去勢1～4周CIA組大鼠血清抗Ⅱ型膠原抗體水平有顯著性差異(P<0.05)。

3.7 CⅡ免疫誘導(dǎo)對不同時間去勢大鼠血漿中IL-6含量的影響

雙因素方差分析統(tǒng)計結(jié)果顯示，性別對IL-6影響有顯著性(P=0.0034)，數(shù)據(jù)顯示性別和分組之間無交互作用(P=0.3356)，去勢時間對IL-6影響有顯著性差異(P<0.0001)，兩兩比較采用LSD法檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，與對照 CIA組比較，去勢2周、3周、4周CIA組大鼠IL-6水平明顯升高(P<0.05)，去勢1周、2周、3周、4周CIA組大鼠血清IL-6水平亦有顯著性差異(P<0.05)，隨著去勢時間增加，明顯升高。

3.8 CⅡ免疫誘導(dǎo)對不同時間去勢大鼠血漿中IL-10含量的影響

圖5 不同時間去勢CIA大鼠血漿IL-6變化

圖6 不同時間去勢CIA大鼠血漿IL-10變化

雙因素方差分析結(jié)果顯示，性別對IL-10影響有顯著性(P<0.0001)。數(shù)據(jù)顯示，性別和分組之間無交互作用(P=0.3356)，去勢時間對IL-10影響有顯著性差異(P<0.0001);兩兩比較采用LSD法檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，各組CIA組大鼠血清IL-10水平隨去勢時間增加，明顯升高，均有顯著性差異(P<0.05)。

3.9 動物行為學(xué)評定

圖1、2顯示，去勢2周后，大鼠無明顯行為形態(tài)異常;去勢3周后，出現(xiàn)活動減少、弓背蜷縮、畏寒喜暖、體毛枯疏、扎堆及飲食減少、肛周污穢等一系列與臨床貼近的腎虛證候。

4 討論

中醫(yī)理論認(rèn)為，腎虛在RA發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，選擇恰當(dāng)?shù)哪I虛模型是研究腎虛型病證結(jié)合動物模型的關(guān)鍵。目前有多種制作腎虛動物模型的方法［13～16］，而去勢法應(yīng)用較為成熟和穩(wěn)定?，F(xiàn)代研究表明，“下丘腦-垂體-靶腺”軸不同環(huán)節(jié)、不同程度的功能紊亂是腎虛證的主要病理基礎(chǔ)。下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA)是神經(jīng)內(nèi)分泌的重要組成部分，糖皮質(zhì)激素(人類主要為皮質(zhì)醇，大鼠主要為CORT)是該軸的終末激素。實(shí)驗(yàn)檢測了大鼠血漿CORT含量，發(fā)現(xiàn)睪丸切除后大鼠的CORT升高，且與去勢時間成正相關(guān)，而卵巢切除后大鼠的CORT水平下降。該結(jié)果說明性激素對腎上腺皮質(zhì)激素有調(diào)節(jié)作用，且這種調(diào)節(jié)作用存在性別差異，有關(guān)其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

CⅡ主要分布于軟骨和眼的玻璃體中，機(jī)體在正常的情況下，CⅡ是一種與免疫系統(tǒng)隔絕的蛋白，但在某些病理?xiàng)l件下卻可作為一種自身抗原呈現(xiàn)出來，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗 CⅡ抗體，誘發(fā)關(guān)節(jié)炎的發(fā)生［17］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CIA大鼠含有大量抗CⅡ抗體，去勢后即腎虛條件下制作的CIA模型，抗CⅡ抗體水平明顯升高，表明抗CⅡ抗體在CIA的發(fā)病過程中起著重要的作用。細(xì)胞因子在RA的病理過程中亦是極為重要的介質(zhì)。IL-6是一種具有活化T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和破骨細(xì)胞等多種功能的細(xì)胞因子［18］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著去勢時間的延長，即腎虛程度的加重，IL-6的含量明顯增加。IL-10主要由Th2細(xì)胞產(chǎn)生，是一種具有很強(qiáng)免疫抑制及免疫調(diào)控作用的細(xì)胞因子，幾種不同的RA動物模型實(shí)驗(yàn)證實(shí)IL-10具有治療作用，能抑制CIA的進(jìn)展，減輕關(guān)節(jié)腫脹和軟骨破壞［19］。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，去勢CIA大鼠血清中IL-10水平較對照CIA組顯著升高。隨著去勢時間的延長，即腎虛程度的加重，IL-10的含量明顯增加。有研究證實(shí)，雖然RA患者血清和關(guān)節(jié)滑液中IL-10水平高于正常，但是仍然處于相對缺乏的狀態(tài)［30］。所以CIA大鼠血漿中IL-10的升高可以視為補(bǔ)償性增加。

本實(shí)驗(yàn)所制作的腎虛型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病證結(jié)合動物模型與人類腎虛型RA相比，有許多相似之處，具體表現(xiàn)在以下幾個方面:(1)動物行為學(xué)特征表現(xiàn)出腎虛證狀態(tài)，主要為活動減少、弓背蜷縮、體毛枯疏、扎堆及飲食減少、肛周污穢等。腎虛相關(guān)因子血漿CORT的變化與人類腎虛時皮質(zhì)醇的變化相似;(2)該模型病理形態(tài)學(xué)改變主要以滑膜病變?yōu)橹鳎c人類腎虛型RA病變亦相似;(3)抗CⅡ抗體在該動物模型上能夠明顯檢出;(4)隨著去勢時間的延長，即腎虛程度加重，CIA發(fā)病率和發(fā)病程度亦隨之增加。這與臨床上腎虛痹證病人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病年齡有向更大年齡移動的趨勢相一致［20～22］。由此可見，本實(shí)驗(yàn)制作的腎虛型RA模型既有明顯的腎虛癥狀，又有明顯的關(guān)節(jié)炎的外部表現(xiàn)，說明是一個成功的病證結(jié)合動物模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著去勢時間的延長，即腎虛程度加重，CIA有效發(fā)病率和發(fā)病程度亦隨之增加，在去勢4周后其有效發(fā)病率就可達(dá)到95%，且發(fā)病程度明顯高于同期未去勢大鼠。在有效發(fā)病率和發(fā)病程度上，雌雄之間并無明顯差異。因此，在制作腎虛痹證(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)病證結(jié)合動物模型時，在大鼠去勢4周時就可用CⅡ進(jìn)行免疫誘導(dǎo)。

［1］Cook A D，Rowley M J，Wines B D，et al.Antibodies to the collagen-like region of C1q and typeⅡcollagen are independent populations in systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis［J］.J Autoimmun，1994，(3):369-378.

［2］Choi E K，Gatenby P A，Bateman J F，et al.Antibodies to typeⅡcollagen in SLE:a role in the pathogenesis of deforming arthristis［J］.Immunol Cell Biol，1990，68(Pt1):27.

［3］Cutolo M，Accuado S.Sex hormones，HLA and rheumatoid arthritis［J］.J Clin Exp Rheumatol，1991，9:641.

［4］艾景錄，呂愛平.性腺功能異常型腎虛痹證發(fā)生機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，1995，(2):142.

［5］Ostensen M，Veiby O P，Raiss R，et al.Reponses of normal and rheumatoid human anticular chondrocyte cultured nuder various experimental conditions in agarose［J］.Scand J Rheumatol，1991，20:172.

［6］呂愛平，王安民，曾嘵蓮.益腎蠲痹丸對大鼠實(shí)驗(yàn)性痹證影響的病理學(xué)研究［J］.中醫(yī)雜志，1989;29(6):49-51.

［7］Clague R B，Moore L J.IgG and IgM antibody to native typeⅡcollagen in rheumatoid arthritis serum and synovial fluid［J］.Arthritis Rheum，1984，27:1370-1376.

［8］Shinmei M，Masuda K，Kikuchi T，et al.Produtions of cytokines by chondrocytes and its role in proteoglycan degradation［J］.J Rheumatol supl，1991，27:89.

［9］鞠大宏，于福祿，張麗坤，等.滋陰補(bǔ)腎法對卵巢切除所致骨質(zhì)疏松大鼠成骨細(xì)胞COX-2蛋白和 mRNA表達(dá)的影響［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2006，14:44-46.

［10］Holmdahl R，Jansson L，Andersson M，et al.Immunogenetics of typeⅡcollagen autoimmunity and susceptibility to collagen arthritis［J］.Immunology，1988，65(2):305.

［11］張鈞田.現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)方法［M］.北京:北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1998:1383.

［12］C.Schneider，Y.Matsumoto.Experimental autoimmunr myositis in the Lewis rat:lack of spontaneous T2 cell apoptosis and therapeutic response to glucocorticosteroid application［J］.Journal of Neuroimmunology，2000，(107):83-87.

［13］呂愛平，朱碗華，徐世杰，等.類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中西醫(yī)結(jié)合應(yīng)用基礎(chǔ)研究［M］.北京:中醫(yī)古籍出版社，1999:92-166.

［14］呂愛平，王安民，艾景錄，等.腎虛痹證發(fā)病機(jī)理研究［J］.中醫(yī)雜志，1995，(8):492.

［15］高崗，楊根金，婁子洋.腎虛證大鼠尿液的核磁共振譜代謝組學(xué)研究［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2009;30:565-568.

［16］陳小野，鄒世潔，王震，呂愛平，艾景錄.大鼠腎上腺次全切除腎陽虛模型胃、舌病理觀察［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，1999，5:20.

［17］Takagishi K，Hotokebuchi T，Arai，et al.Collagen arthritis in rats:the importance of humoral immunity in the initiation of the disease and perpetuation of the disease by suppressor T cell［J］.Intern Ren Immunol，1998，4:35-48.

［18］Choy E.Clinical experience with inhibition of interleukin-6［J］.RheumDis Clin North Am，2004，30:405-415.

［19］Joosten LA，Lubberts E，Durez P，et al.Role of interleukin-4 and interleukin-10 in murine collagen-induced arthritis;protective effect of interleukin-4 and interleukin-10 treatment on cartilage destruction［J］.Arthritis Rheum，1997，40:249-260.

［20］Kaipiainen-Seppanen O，Aho K，Laakso M.Shift in the incidence of rheumatoid arthritis toward elderly patients in Finland during 1975-1990［J］.Clin Exp Rheumatol，1996，14:537-542.

［21］Doran MF，Pond GR，Crowson CS，et al.Trends in incidence and mortality in rheumatoid arthritis in Rochester，Minnesota，over a forty-year period［J］.Arthritis Rheum，2002，46:625-631.

［22］Imanaka T，Shichikawa K，Inoue K，et al.Increase in age at onset of rheumatoid arthritis in Japan over a 30 year period［J］.Ann Rheum Dis，1997，56:313-336.