志賀菌耐多藥相關(guān)基因水平轉(zhuǎn)移的驗證及其耐藥性研究*

王淑玲,宋春花,段廣才,張衛(wèi)東,郗園林,朱靜媛

志賀菌耐多藥相關(guān)基因水平轉(zhuǎn)移的驗證及其耐藥性研究*

王淑玲,宋春花,段廣才,張衛(wèi)東,郗園林,朱靜媛

目的對志賀菌耐多藥相關(guān)基因(T1C4)水平轉(zhuǎn)移進(jìn)行驗證,并對其與細(xì)菌耐藥性的關(guān)系進(jìn)行初步判定。方法培養(yǎng)已篩選出的包含T1C4基因片段的陽性克隆,提取其質(zhì)粒,PCR擴(kuò)增T1C4基因片段、純化、制備探針,與志賀菌敏感株SS23、志賀菌耐多藥轉(zhuǎn)移株(ST11)、大腸埃希菌耐多藥株(E667)的基因組DNA和質(zhì)粒DNA進(jìn)行斑點雜交。采用藥敏紙片法研究含T1C4基因片段大腸埃希菌的耐藥性。結(jié)果應(yīng)用PCR方法可以從ST11和E667菌株基因組DNA中擴(kuò)增出T1C4基因片段,而SS23菌株不含該基因片段;應(yīng)用T1C4基因探針進(jìn)行斑點雜交顯示,ST11和E667菌株的全基因組和質(zhì)粒DNA均可顯示雜交信號,而SS23菌株的基因組和質(zhì)粒DNA均不產(chǎn)生雜交信號;14種藥物的藥敏試驗表明,含有T1C4基因的大腸埃希菌(DH5α)對四環(huán)素、先鋒V、頭孢噻吩、氟哌酸、復(fù)方新諾明等五種藥物的抑菌環(huán)直徑明顯小于(相差 3mm以上)不含T1C4基因的DH5α菌株。結(jié)論T1C4基因片段為ST11菌株從E667菌株獲得,且存在于兩菌株的質(zhì)粒上;T1C4基因可能介導(dǎo)細(xì)菌對多種藥物的抗性。

志賀菌;耐多藥;基因水平轉(zhuǎn)移

細(xì)菌可通過自身基因突變和耐藥基因的獲得2種途徑產(chǎn)生耐藥性〔1〕,并且外源性耐藥基因的獲得,即耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移,是臨床耐藥菌株產(chǎn)生的主要途徑之一〔2〕。為了系統(tǒng)研究耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移,本課題組利用臨床分離的大腸埃希菌耐多藥株(E667)作為供體菌,志賀菌敏感株(以下簡稱敏感株或SS23)作為受體菌,經(jīng)實驗室液體接合試驗,成功獲得了一株志賀菌耐多藥轉(zhuǎn)移株(以下簡稱轉(zhuǎn)移株或ST11);通過敏感株和轉(zhuǎn)移株基因組DNA抑制性消減雜交文庫的構(gòu)建以及篩選和鑒定,獲得了多個可能與耐多藥相關(guān)的基因片段〔3〕。本文對已篩選出的一個未知功能的基因片段(T1C4)在基因組上的位置進(jìn)行確定,并對其與細(xì)菌耐藥性的關(guān)系進(jìn)行初步研究。結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集河南省鄭州市鄭州大學(xué)附屬醫(yī)院腹瀉患者糞便培養(yǎng)細(xì)菌標(biāo)本,在就診醫(yī)院鑒定后,送本實驗室重新進(jìn)行生化和血清學(xué)鑒定。然后對收集的臨床分離志賀菌及大腸埃希菌進(jìn)行篩選,用頭孢噻吩、諾氟沙星、慶大霉素、磺胺甲基異惡唑四種抗生素采用Kirby-Bauer紙片瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗。大腸埃希菌耐多藥株(E667):對上述四種抗生素均耐藥,分離自鄭州大學(xué)一附院;志賀菌敏感株(SS23):對上述四種抗生素均敏感,分離自鄭州大學(xué)三附院;志賀菌耐多藥轉(zhuǎn)移株(ST11):由E667作為供體菌,SS23作為受體菌進(jìn)行液體接合試驗,在上述四種抗生素選擇壓力下獲得〔3〕。

1.2 試劑 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒及瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(北京天根試劑公司),DNA標(biāo)記檢測試劑盒(德國ROCHE公司),限制性內(nèi)切酶HinfI(日本TAKARA生物公司),PCR相關(guān)試劑(北京天根生物公司),MH培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)公司),14種抗生素紙片:先鋒V(Cefazolin)、頭孢噻吩(Cefalotin)、先鋒噻肟(Claforan)、慶大霉素(Gentamycin)、鏈霉素(Streptomycin)、妥布霉素(Tobramycin)、四環(huán)素(Tetrocycline)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin)、左氧氟沙星(Levofloxacin)、諾氟沙星(氟哌酸)(Norfloxacin)、奈啶酸(Nalidixic acid)、氯霉素(Chloramphenicol)、復(fù)方新諾明(SMZ-TMP)、呋喃妥因(Nitrofurantoin)產(chǎn)自杭州天和微生物試劑公司。

1.3 引物 引物由北京賽百勝生物公司合成,第一輪PCR引物為巢式PCR的外側(cè)引物:N1:5′-TCG AGC GGC CGC CCG GGC AGGT-3′和 N2R:5′-AGC GTG GTC GCG GCC GAG GT-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物是T1C4基因片段。第二輪PCR所用引物根據(jù)本實驗室已經(jīng)測得的T1C4序列,利用PRIMER 5.0軟件自行設(shè)計;P1∶5′-GGG CAG GTA CAC NNN NNN AAA CAC T-3′;P2:5′-GCATCT GCT NNN NNN TGG T TT G-3′;其擴(kuò)增產(chǎn)物為 T1C4的中間序列。

1.4 方法

1.4.1 質(zhì)粒DNA及全基因組DNA提取 菌株培養(yǎng)根據(jù)參考文獻(xiàn)進(jìn)行〔4〕;采用堿裂解小量提取質(zhì)粒DNA法獲得菌株質(zhì)粒DNA,具體步驟按照分子克隆第3版進(jìn)行〔5〕;細(xì)菌全基因組DNA的提取利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒完成。提取后的質(zhì)粒DNA(基因組 DNA)各取 3μ L,用 1%瓊脂糖凝膠5V/cm電壓電泳35min,0.5μ g/mL溴化乙錠染色,紫外燈下觀察結(jié)果。核酸相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為DL2000 DNA Marker。

1.4.2 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 第一輪 PCR在25μ L體系中進(jìn)行,反應(yīng)體系參照文獻(xiàn)混合〔6〕。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min,PCR循環(huán)參數(shù)參照文獻(xiàn)〔7〕完成。

第二輪PCR在50μ L體系中進(jìn)行,模板為第一輪PCR產(chǎn)物,反應(yīng)體系詳見參考文獻(xiàn)〔8〕。反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5 min,PCR循環(huán)參數(shù)為:94℃30s,61℃30s,72℃60s,共32個循環(huán),最后 72℃延伸10min。各取第一輪和第二輪PCR產(chǎn)物5μ L,用1.5%瓊脂糖5V/cm電壓電泳30min,0.5μ g/mL溴化乙錠染色,紫外燈下觀察結(jié)果。核酸相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為DL2000 DNA Marker。

1.4.3Hinf I酶切鑒定陽性克隆 對第二輪PCR產(chǎn)物Hinf I內(nèi)切酶酶切鑒定。具體操作過程按照文獻(xiàn)〔9〕和內(nèi)切酶Hinf I說明書完成。

1.4.4 探針標(biāo)記與斑點雜交 將第二輪PCR擴(kuò)增的基因產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化后(具體步驟根據(jù)該試劑盒說明書完成),采用隨機(jī)引物法地高辛標(biāo)記作為T1C4基因片段的探針。檢測探針的標(biāo)記效率〔10〕,根據(jù)標(biāo)記的效率選擇合適的探針濃度。取菌株 E667、SS23、ST11的質(zhì)粒和基因組DNA各2μ L,100℃變性 10min,迅速置冰中5min,將變性后的DNA點在尼龍膜上,在含有探針的雜交液中雜交,應(yīng)用地高辛試劑盒檢測雜交結(jié)果。具體操作步驟根據(jù)文獻(xiàn)〔10-11〕完成。

1.4.5 藥敏試驗 采用WHO推薦的改良Kirby-Bauer紙片,其結(jié)果判定參照衛(wèi)生部制定的《紙片法抗菌藥物敏感試驗標(biāo)準(zhǔn)》(WS/T125-1999),質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922株(購自中國藥品生物制品檢定所)。為保證結(jié)果的可靠性,每個菌株對同一種抗生素的耐藥性實驗在相同條件下重復(fù)兩次。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物的瓊脂糖電泳 分別以E667、SS23、ST11基因組 DNA 為模板,應(yīng)用N1和N2R引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增,結(jié)果E667、ST11均可擴(kuò)增出T1C4基因片段全序列,長度805bp(見圖1-A),而SS23擴(kuò)增不出這一片段。分別以上述擴(kuò)增出的DNA片段為模板,應(yīng)用P1和P2引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增,均可產(chǎn)生長度671bp的片段(見圖1-B),與預(yù)期結(jié)果一致。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果Fig.1 PCR amplified analysis of gene T1C4

2.2 PCR產(chǎn)物的酶切檢定 根據(jù)已知序列分析,第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Hinf I酶切后,應(yīng)產(chǎn)生281bp和390bp兩條片段,電泳結(jié)果與預(yù)期一致(見圖2)。

圖2 第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Hinf I酶切電泳M:DL 2000 DNA marker;Q:酶切產(chǎn)物;W:第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 Analysis of the 2ndPCR amplified products digestedwith Hinf IM,DL 2000 DNA marker;Q:2ndPCR amplified products digested with Hinf I;W:2ndPCR amplified products

2.3 T1C4探針與待檢測DNA斑點雜交 應(yīng)用已標(biāo)記的T1C4基因探針分別與 E667、SS23、ST11的基因組DNA和質(zhì)粒 DNA進(jìn)行雜交,結(jié)果E667、ST11的基因組DNA和質(zhì)粒DNA均可產(chǎn)生雜交信號,而與SS23的基因組DNA和質(zhì)粒均沒有雜交信號,見圖 3。這一結(jié)果說明E667和ST11均含有T1C4,且這一基因片段位于兩菌株的質(zhì)粒上。

2.4 細(xì)菌藥敏試驗 應(yīng)用14種抗生素對大腸埃希菌 DH5α、DH5α(pUC18)、DH5α(pUC18-T1C4)菌株進(jìn)行藥敏試驗,結(jié)果見表 1。從表1可以看出,DH5α(pUC18-T1C4)菌株對四環(huán)素、先鋒 V、氯霉素、頭孢噻吩、氟哌酸、復(fù)方新諾明等六種抗生素的抑菌環(huán)直徑明顯小于DH5α、DH5α(pUC18)。

圖3 探針與待檢測DNA的斑點雜交Fig.3 Dot bolt hybridization with T1C4 gene probe

表1 菌株藥敏試驗

3 討 論

基因水平轉(zhuǎn)移研究是研究基因的結(jié)構(gòu)與功能的重要工具,通過研究不僅可以發(fā)現(xiàn)哪些基因可以發(fā)生水平轉(zhuǎn)移,而且還能發(fā)現(xiàn)該基因在微生物群落中的行為表現(xiàn)。盡管點突變可以影響細(xì)菌菌株的毒力表型,但是通過水平轉(zhuǎn)移獲取毒力基因在病原菌的進(jìn)化過程中更為普遍〔12〕。因此,基因水平轉(zhuǎn)移研究可使我們在一定程度上預(yù)測將來可能出現(xiàn)的新病原菌,并對預(yù)防新型傳染病的出現(xiàn)具有一定的指導(dǎo)意義。

基因水平轉(zhuǎn)移在微生物中尤其常見,其被認(rèn)為是微生物適應(yīng)新環(huán)境的一種需求〔13-14〕。目前,已知參與水平轉(zhuǎn)移的基因大多與細(xì)菌的抗藥性和致病性有關(guān)〔12〕。為了系統(tǒng)的研究耐藥基因在細(xì)菌間的轉(zhuǎn)移情況,本課題組設(shè)計了一種基于同一遺傳背景下的細(xì)菌基因水平轉(zhuǎn)移模型,并從志賀菌敏感株中獲得了一株轉(zhuǎn)移耐多藥菌株。此前的比較基因組學(xué)研究表明,該轉(zhuǎn)移株可能從供體菌中獲得了多個基因。本實驗應(yīng)用PCR、斑點雜交等方法證明,該轉(zhuǎn)移株所含有的T1C4基因片段來自供體菌,而且該基因片段在供體菌株和轉(zhuǎn)移株中都存在于質(zhì)粒上,這一結(jié)果確定了該基因片段在基因組上的位置,也證明了質(zhì)粒在細(xì)菌基因水平轉(zhuǎn)移中的重要意義。

通過比較3株不同的大腸埃希菌對14種抗生素的敏感性,發(fā)現(xiàn)與DH5α和 DH5α(pUC18)菌株相比,DH5α(pUC18-T1C4)菌株對其中6種抗生素具有一定的抗性。這一結(jié)果顯示,T1C4基因片段可能介導(dǎo)細(xì)菌對多種抗生素的耐性。但是,本實驗僅對該基因片段可能介導(dǎo)的耐藥性做了耐藥類型的篩選,具體在細(xì)菌耐藥過程中扮演何種角色,尚需要作更進(jìn)一步的研究。

〔1〕Tan YT,Tillett DJ,McKay lA.M olecular strategies for overcoming antibiotic resistance in bacteria〔 J〕.Molecular M edicine Today,2000,6(8):309-314.

〔2〕Hawkey PM.M olecular epidemiology of clinically significant antibiotic resistance genes〔J〕.British Journal of Pharmacology,2008,153(1):S406-S413.

〔3〕宋春花.志賀菌多重耐藥的分子機(jī)制研究〔D〕.鄭州大學(xué)博士學(xué)位論文,2007:20.

〔4〕Danquah M K,Forde GM.Growth medium selection and its oconomic impact on plasmid DNA production〔J〕.Bioscience and Bioengineering,2007,104(6):490-497.

〔5〕Sambrook J,Russell DW.分子克隆實驗指南(上冊)〔M〕 .3版.北京:科學(xué)技術(shù)出版社,2002:27-30.

〔6〕Borchardt SM,Foxman B,Chaffin DO,et al.Comparison of DNA dot blot hybridization and lancefield capillary precipitin methods for g roup B streptococcal capsular typing〔J〕.Clinical Microbiology,2004,42(1):146-150.

〔7〕Xie JJ,Foxman B,Zhang LX,et al.Molecular epidemiologic identification ofEscherichia coligenes that are potentially involved in movement of the organism from the intestinal tract to the vagina and bladder〔J〕.Clinical Microbiology,2006,44(7):2434-2441.

〔8〕Cattoir V,Poirel L,Rotimi V,et al.Multiplex PCR for detection of plasmid-mediated quinolone resistance qnr genes in ESBL-producing enterobacterial isolates〔J〕.Antimicrobial Chemotherapy,2007,60(2):394-397.

〔9〕朱靜媛,段廣才,郗園林.志賀菌對喹諾酮類藥物耐藥分子機(jī)制的研究〔J〕.中華流行病學(xué)雜志,2004,25(3):245-247.

〔10〕Wang KY,Guo YJ,Sun SH,et al.16S rRNA gene probe quantitates residual host cell DNA in pharmaceutical-g rade plasmid DNA〔J〕.Vaccine,2006,(24):2656-2661

〔11〕Li YH,Pan YP,Qi FX,et al.Identification ofStreptococcus sanguiniswith a PCR-Generated species-specific DNA probe〔J〕.Clinical Microbiology,2003,41(8):3481-3486

〔12〕Dutta C,Pan A.Horizontal gene transfer and bacterial diversity〔J〕.Indian Acad Sci,2002,27(1):27-33.

〔13〕Gogarten JP,Doolittle WF,Lawrence JG.Prokaryotic evolution in light of gene transfer〔J〕.Molecular Biology and Evolution,2002,19(12):2226-2238

〔14〕Zaneveld JR,Nemergut DR,Knight R.A re all horizontal gene transfers created equal?Prospects for mechanism-based studies of HG T patterns〔J〕.Microbiology,2008,154(1):1-15.

Identification on horizontal transfer of multi-drug resistance related gene fragment ofShigellaand its drug-resistance

WANG Shu-ling,SONG Chun-hua,DUAN Guang-cai,ZHANG Wei-dong,XI Yuan-lin,ZHU Jing-yuan
(Department of Epidemiology,College of Public Health,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China)

The objective of the present study was to identify horizontal transfer of gene fragment(T1C4)fromE.colitoShigellaand its relationship with multi-drug resistance.Screened positive clone which contains T1C4 gene fragment was cultured and the plasmid was extracted.The fragment of T1C4 gene was then amplified by PCR and purified by gel purification kit.The probe was prepared and the dot hybridization was conducted for genomic DNA and plasmid DNA ofShigellasensitive strain(SS23),transferred multi-drug resistantShigellastrain(ST11)andEscherichia colimulti-drug resistant clinical strain(E667).Finally,antimicrobial sensitivity of DH5α,DH5α(pUC18),DH5α(pUC18-T1C4)and ATCC25922 were detected by disk diffusion testing.The procedure was carried out in accordance with the guidelines in standard of antibiotics susceptibility test(Kirby-Bauer method)document.Results displayed that T1C4 gene fragment was amplified from genomic DNA of ST11 and E667 by PCR.The genomic DNAs and plasmid DNAs of transferred strain(ST11)and clinical strain(E667)all gave positive signals in dot hybridization,whereas both of genomic DNA and plasmid DNA of SS23 gave negative hybridization signal.The bacteriostatic diameters of Tetracycline,Cefazolin,Cefalotin,Norfloxacin and SMZ-TMP to DH5α(pUC18-T1C4)were significantly shorter than those to DH5α(pUC18).It's concluded that gene fragment(T1C4)was transferred from E667 to ST11 with plasmid.Moreover,T1C4 gene fragment might be closely related to multi-drug resistance of bacteria.

dot hybridization;horizontal gene transfer;Shigella;multi-drug resistance

R378.2

A

1002-2694(2010)09-0814-04

*衛(wèi)生部科研基金資助課題(WKJ2007-2-024)

段廣才,Email:gcduan@public.zz.ha.cn

鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,河南省分子醫(yī)學(xué)重點學(xué)科開放實驗室,鄭州 450001

2009-07-19;

2010-01-09