卵巢癌患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的檢測(cè)及其臨床意義

溫 巖,孫曉艷,何 津,于曉偉*

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院 1 .婦產(chǎn)科;2.放射科,吉林 長(zhǎng) 春 130021)

卵巢癌患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的檢測(cè)及其臨床意義

溫 巖1,孫曉艷2,何 津1,于曉偉1*

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院 1 .婦產(chǎn)科;2.放射科,吉林 長(zhǎng) 春 130021)

目的探討卵巢癌患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例變化及其可能的機(jī)制。方法利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)20例卵巢癌患者外周血淋巴細(xì)胞(peripheral blood lymphocytes,PBLs)、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocytes,TILs)及腫瘤相關(guān)淋巴細(xì)胞(tumor associated lymphocytes,TALs)中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞(CD4+CD25+T cells,Tregs)所占的比例。10例健康人外周血PBLs中Tregs所占的比例。同時(shí)檢測(cè)卵巢癌患者CD4+外周血淋巴細(xì)胞中CD69+細(xì)胞的比例。健康人PBLs在含有卵巢癌細(xì)胞株SKOV3培養(yǎng)上清的RPMI1640培養(yǎng)液(有或沒(méi)有血清植物血凝素)中培養(yǎng)72小時(shí)后,檢測(cè)Tregs所占的比例。結(jié)果卵巢癌患者外周血淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞所占比例與健康人相比明顯增加.卵巢癌患者外周血腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞所占比例高于在外周血淋巴細(xì)胞和腫瘤相關(guān)淋巴細(xì)胞中的比例,但是沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。卵巢癌患者CD4+外周血淋巴細(xì)胞中無(wú)CD69表達(dá)。結(jié)論卵巢癌患者外周血淋巴細(xì)胞中、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞及腫瘤相關(guān)淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞所占的比例增加,這可能與卵巢癌細(xì)胞分泌的可溶性分子上調(diào)有關(guān)。

卵巢癌;免疫抑制;調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1402)

卵巢癌的致死率占各類婦科腫瘤的首位,5年生存率僅為25%-30%,嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。隨著免疫學(xué)和基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展,免疫治療已被認(rèn)為是提高卵巢癌患者存活率的一種治療選擇,進(jìn)而關(guān)于卵巢癌細(xì)胞免疫的研究就引起了研究者的關(guān)注。腫瘤局部免疫微環(huán)境中,可見(jiàn)到腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)或其它免疫細(xì)胞,但免疫細(xì)胞的數(shù)量、表型和功能卻與正常人組織中的免疫細(xì)胞有著巨大差別,其中Tregs在腫瘤免疫中尤為引人關(guān)注,是影響TIL體內(nèi)抗腫瘤效果的主要因素。Tregs是T細(xì)胞的一種,主要指CD4+CD25+Treg,具有阻止自身免疫病和炎癥疾病的發(fā)生,也能抑制有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答[1-3]。CD4+CD25+Treg約占人和小鼠外周血CD4+T細(xì)胞的5%-10%。大量研究表明,在大多數(shù)腫瘤患者中抗腫瘤免疫功能低下與 CD4+CD25+Treg有關(guān)[4-6]。目前研究發(fā)現(xiàn)多種腫瘤患者外周血和腫瘤區(qū)域及淋巴結(jié)中Treg的比重顯著高于正常人。已經(jīng)證實(shí),通過(guò)各種途徑清除CD4+CD25+Treg或下調(diào)其活性可顯著增加其抗腫瘤活性[7-11]。從臨床角度研究腫瘤患者體內(nèi)CD4+CD25+Treg數(shù)量和功能的變化,揭示這種變化和疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系,可為腫瘤的免疫治療提供理論依據(jù)。本文探討卵巢癌患者CD4+CD25+Treg的比例變化及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 20例卵巢癌患者均為2007年10月-2009年1月在本院婦產(chǎn)科住院患者,經(jīng)手術(shù)病理均證實(shí)為上皮性卵巢癌。FIGO分期:Ⅰ期3例,Ⅱ期2例,Ⅲ期12例,Ⅳ期3例。病理類型:16例漿液性上皮性卵巢癌,4例粘液性上皮性卵巢癌。年齡44-65歲,平均 56.3±12.7歲。10例正常對(duì)照組均為門診健康體檢者,年齡20-57歲,平均52.3±10.1歲。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 鼠抗人IgG抗體,FITC-抗CD25抗體、PE-CY5抗CD4抗體、FITC-抗CD69抗體及同型對(duì)照抗體均購(gòu)自美國(guó)CALTAG公司。RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone公司。胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。卵巢癌細(xì)胞株SKOV3購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC)。

1.2.2 PBLs,TILs,and TALs細(xì)胞分離 外周血利用胎牛血清2∶1稀釋,利用密度梯度分離法分離,室溫下2 500 rpm25分鐘,獲得PBLs。

腫瘤組織無(wú)菌條件下粉碎胰蛋白酶消化25分鐘,取懸浮液過(guò)濾后,PBS洗3次,利用密度梯度分離法分離,室溫下2 500 rpm25分鐘,收集下層細(xì)胞,獲得TILs。

腹水或腹腔沖洗液室溫下1 500 rpm離心15分鐘,利用密度梯度分離法分離,室溫下2 500 rpm25分鐘,收集下層細(xì)胞,獲得TALs。

1.2.3 流式細(xì)胞儀 樣品應(yīng)用EPICS XL-ADC流式細(xì)胞分析儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司)上機(jī)檢測(cè),檢測(cè)PBLs,TILs,and TALs細(xì)胞中CD4+CD25+T細(xì)胞的比例;卵巢癌患者CD4+PBL中CD69+細(xì)胞的比例。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng) 卵巢癌細(xì)胞株SKOV3在加有10%熱滅后胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng),80%匯聚后再在未加入胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)48小時(shí),離心濾過(guò)后取上清,-20℃保存。

為了探討卵巢癌細(xì)胞株培養(yǎng)液對(duì)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的效應(yīng),10例健康人 PBLs在 RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng),培養(yǎng)72小時(shí)后加入卵巢癌細(xì)胞株SKOV3培養(yǎng)液。后者再分為加入PHA及未加入PHA兩組,上機(jī)檢測(cè)不同情況的CD4+CD25+T細(xì)胞的比例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例增加

卵巢癌患者PBLs中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的32.45%,與正常對(duì)照組(5.2%)相比明顯增加,差異顯著(P＜0.05)。見(jiàn)圖1。

卵巢癌患者TILs和 TALs中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞所占的比例分別為43.8%、33.6%;晚期卵巢癌患者 PBL、TIL及 TAL中 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞所占比例高于早期卵巢癌患者,但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。卵巢癌患者CD4+PBLs中CD69表達(dá)陰性。見(jiàn)圖2。

2.2 卵巢癌細(xì)胞株SKOV3培養(yǎng)液可以增加CD4+CD25+T細(xì)胞的表達(dá)

正常健康人PBLs在RPMI1640加入50%卵巢癌細(xì)胞株SKOV3培養(yǎng)液(有或沒(méi)有PHA,10 μ g/ml))中培養(yǎng)后,CD4+CD25+Tregs所占比例高于沒(méi)有加入卵巢癌細(xì)胞株SKOV3培養(yǎng)液中的比例。見(jiàn)表1。

圖1 A正常健康人PBLs中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞流式檢測(cè)結(jié)果 B-D卵巢癌患者PBLs、TILs及TAL中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞流式檢測(cè)結(jié)果

圖2 卵巢癌患者 CD4+PBLs中 CD69的表達(dá)陰性

表1 卵巢癌細(xì)胞株培養(yǎng)液對(duì)CD4+CD25+Tregs的效應(yīng)

3 討論

近年來(lái)研究表明許多腫瘤抗原為自身抗原,CD4+CD25+tregs能抑制T細(xì)胞對(duì)外來(lái)和自身抗原的免疫應(yīng)答,因而在維持對(duì)自身成分耐受的同時(shí)也會(huì)阻止機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答,從而導(dǎo)致了腫瘤的免疫逃逸。1999年Onizuka[12]首先通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明CD4+CD25+Treg抑制針對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答,使人們開(kāi)展了對(duì)這類細(xì)胞和腫瘤相互關(guān)系的基礎(chǔ)理論研究。

Wolf和Ormandy等[13-15]發(fā)現(xiàn)在卵巢癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、肝癌等多種腫瘤患者外周血和腫瘤局部CD4+CD25+Treg比例增高,且數(shù)量與患者腫瘤進(jìn)展程度和預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。Woo等報(bào)道大于30%肺癌患者CD4+PBLs and TILs共表達(dá)CD25[13]。本研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者PBLs中CD4+CD25+Treg明顯增加,而且晚期患者Treg相對(duì)更高,提示卵巢癌患者體內(nèi)存在CD4+CD25+Treg增高。CD4+CD25+Treg增高可能激活了宿主對(duì)于腫瘤的免疫抑制作用。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者TIL中CD4+CD25+Treg所占比例明顯高于PBLs和TALs中的比例,但是沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這提示腫瘤局部微環(huán)境中免疫受抑制更明顯。CD69是T細(xì)胞活化的標(biāo)記物之一。本研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者CD4+PBLs中CD69表達(dá)陰性,提示卵巢癌患者 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增加并不是由于活化T細(xì)胞的增加。

腫瘤患者外周血、淋巴結(jié)和腫瘤局部CD4+CD25+Treg數(shù)量增加,這一現(xiàn)象可能的解釋有兩種:腫瘤誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的增殖;或調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原刺激的生理性增殖。至今仍缺乏實(shí)驗(yàn)室證據(jù)證明上述任何一種假說(shuō)。為了探討卵巢癌患者局部微環(huán)境中CD4+CD25+Treg增加的機(jī)制。本研究檢測(cè)了健康人PBLs培養(yǎng)基中加入卵巢癌細(xì)胞株SKOV3培養(yǎng)液前后CD4+CD25+Treg的比例變化,結(jié)果顯示加入卵巢癌細(xì)胞株SKOV3培養(yǎng)液后CD4+CD25+Treg的比例增加。為了進(jìn)一步證實(shí)這種變化不是由于活化T細(xì)胞增殖的原因,本研究繼續(xù)在上述加入卵巢癌細(xì)胞株SKOV3培養(yǎng)液的PBLs培養(yǎng)基中加入PHA,CD4+CD25+Treg的比例同步增加。因此推測(cè)卵巢癌上皮細(xì)胞分泌一定的可溶性分子,他們誘導(dǎo)卵巢癌患者外周血及腫瘤局部微環(huán)境中的CD4+CD25+Treg增加。

本研究結(jié)果顯示卵巢癌患者體內(nèi)CD4+CD25+Treg增加,推測(cè)是由于卵巢癌上皮細(xì)胞分泌的可溶性分子有關(guān)。由此,探討卵巢癌局部微環(huán)境中CD4+CD25+Treg增加的原因及如何清除CD4+CD25+Treg或下調(diào)其活性,成為提高TIL卵巢癌免疫治療效果的焦點(diǎn)。

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The detection of CD4+CD25+regulatory T cells of ovarian cancer patients and clinical significance

WEN Yan,SUN Xiaoyan,HE Jin,et al.(The First Hospital of Jilin University,Changchun130021,China)

ObjectiveTo study the frequence of the CD4+CD25+regulatory in the patientswith ovarian carcinoma and its possible mechanism.MethodsThe percentages of CD4+CD25+T cells in the peripheral blood lymphocytes(PBLs),tumorinfiltrating lymphocytes(TILs)and tumor associated lymphocytes(TALs)from 13 patients with ovarian carcinoma and in the PBLs from 14 healthy women were determined by flow cytometry.The expression of CD69 on CD4+PBLs from thepatients was detected.PBLs from healthy women were cultured in complete RPMI 1640 containing the supernatant from SKOV3 cell line with or without PHA(phytohemagglutinin)stimulationfor 72 hours,then the percentage of CD4+CD25+T cellswas detected.ResultsCD4+CD25+T cells in the PBLsfrom patientswith ovarian carcinoma were significantly increased comparedwith the control.The percentage of CD4+CD25+T cells in TILs was higher than that inPBLs and TALsfrom the patients,but not significantly.The expression of CD69 on CD4+PBLs from the patientswas negative.ConclusionThere is anincreasing of the proportion of CD4+CD25+T cells in PBLs,TILs and TALs of the patients with ovarian carcinoma,which probably results from up-regulation ofsoluble factor secreted by ovarian carcinoma cells.

Ovarian carcinoma;Immunosuppression;regulatory T cell

R737.31

A

1007-4287(2010)09-1402-04

吉林省科技廳白求恩基金資助(20070175)

*通訊作者

2009-12-07)