原花青素對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷代謝障礙的影響

陳香紅 張 艷

1)鄭州市第一人民醫(yī)院 鄭州 450004 2)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室 鄭州 450052

在腦缺血再灌注損傷過程中,腦組織常常伴有代謝障礙,如乳酸含量的增加,能量代謝酶活性的降低,腦細(xì)胞水腫等的發(fā)生。以上改變最終會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙、神經(jīng)元損傷及壞死。原花青素(PC)是一種來源于植物的天然多酚類化合物,具有廣泛的藥理活性,近年研究表明,它可通過抗凋亡、抗氧化、清除自由基在局灶性腦缺血損傷中發(fā)揮腦保護(hù)作用[1-4],本文主要探討原花青素對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注代謝障礙的影響,從而進(jìn)一步研究其腦保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑 原花青素(安陽晶森天然產(chǎn)物有限公司,批號(hào):07031802);乳酸檢測(cè)試劑盒和ATP酶檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號(hào):20070925)

1.2 主要儀器 722紫外分光光度計(jì),電動(dòng)玻璃勻漿機(jī),手術(shù)器械等。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 實(shí)驗(yàn)采用健康成年雄性SD大鼠,體質(zhì)量250～280 g,購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)前室溫下(20～25℃)保持明/暗交替各12 h,環(huán)境適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,給予普通飼料和自由飲水。將80只SD大鼠隨機(jī)分為5組,每組16只,即假手術(shù)組、模型組及 3個(gè) PC劑量(50、100、200 mg/kg)組,模型組和各藥物組分別在大鼠腦缺血2 h后進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分,再灌注24 h后處死大鼠。

1.4 給藥方式 采用腹腔給藥的方式,各劑量藥物組分別于術(shù)前0.5 h注射不同濃度的原花青素溶液,腦缺血后2 h重復(fù)給藥1次。假手術(shù)組和模型組分別給予等量的生理鹽水。

1.5 模型制備 將市售尼龍魚線剪成約50 cm長的線段,用蚊香將線段一端頭部燙成光滑圓球(直徑約為5 mm),在距頭端 20 mm處用紅色記號(hào)筆作標(biāo)記,然后將線段置于75%酒精中備用;用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠,仰臥位固定,作頸部正中切口,分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)和翼腭動(dòng)脈(PPA);結(jié)扎ECA主干和PPA,在CCA上近CCA和ICA的分叉處用眼科剪剪一小口,由此切口插入備用線段,經(jīng)CCA進(jìn)入ICA,繼續(xù)緩慢將魚線向ICA入顱方向推進(jìn),微遇阻力時(shí)停止進(jìn)線,表明魚線頭端已經(jīng)到達(dá)大腦中動(dòng)脈(M CA)起始處,插入深度自頸總動(dòng)脈分叉處至MCA起始處為17～19 mm,即完成了右側(cè)MCA的阻塞。缺血2 h后提拉線段,實(shí)現(xiàn)MCA的再灌注[5-7]。

1.6 神經(jīng)功能評(píng)分 采用Longa[8]評(píng)分法對(duì)缺血2 h后清醒動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):0分:無明顯神經(jīng)病學(xué)癥狀;1分:不能完全伸展左側(cè)前爪;2分:向左側(cè)旋轉(zhuǎn);3分:行走時(shí)向左側(cè)傾倒;4分:不能自動(dòng)行走,意識(shí)水平下降。對(duì)于評(píng)分≥2分且再灌注24 h后仍存活的大鼠篩選入組進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

1.7 腦水腫的測(cè)定 在腦缺血再灌注后處死大鼠,取出右側(cè)大腦組織,用濾紙吸干表面水分,立即于電子天平稱重(濕質(zhì)量),120℃恒溫烘烤24 h至恒重后再次稱重(干質(zhì)量),采用干濕質(zhì)量法測(cè)定腦組織含水量,按Ellis公式[9]計(jì)算腦組織含水量:腦含水量=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100%。

1.8 腦組織勻漿的制備 將大鼠按時(shí)斷頭,取右側(cè)腦組織,稱取腦組織塊約0.5 g,用預(yù)冷的生理鹽水沖洗組織表面的血液,濾紙吸干,再次稱重放于電動(dòng)玻璃勻漿器中,按0.1 g∶0.9 mL加入預(yù)冷的生理鹽水制成腦組織勻漿,再以3 000～4 000 rpm的速度低溫離心10 min,取上清液,即為10%的腦組織勻漿,分裝,放-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9 乳酸含量及能量代謝酶活性的測(cè)定 取上述腦組織勻漿,應(yīng)用722紫外分光光度計(jì),按測(cè)試劑盒說明書測(cè)定乳酸含量、Na+-K+-ATP酶活性、Ca2+-ATP酶活性。考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白的含量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理數(shù)據(jù)。所得結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。多組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析檢驗(yàn),2組間比較采用LSD檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分 與假手術(shù)組相比,模型組神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分升高(P＜0.05);與模型組相比,PC中、高劑量組神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分降低(P＜0.05),而低PC劑量組神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分無顯著變化(P＞0.05);PC中、高劑量組神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

2.2 腦組織含水量 與假手術(shù)組相比,模型組腦組織含水量升高(P＜0.05);與模型組相比,PC高、中劑量組腦組織含水量有所降低(P＜0.05),而低PC劑量組腦組織含水量無顯著變化(P＞0.05);PC中、高劑量組腦組織含水量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 PC對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷神經(jīng)功能評(píng)分及腦組織含水量的影響 (±s,n=8)

表1 PC對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷神經(jīng)功能評(píng)分及腦組織含水量的影響 (±s,n=8)

注:與假手術(shù)組比較,*P＜0.05;與模型組比較,▲P＜0.05

組別 PC劑量(mg/kg) 神經(jīng)功能評(píng)分 腦組織含水量(%)假手術(shù)組 0 0.80±0.34 76.30±0.21模型組 0 3.00±0.31* 80.65±0.19*PC低劑量組 50 2.80±0.33 80.37±0.34 PC中劑量組 100 2.00±0.30▲ 78.23±0.26▲PC高劑量組 200 1.80±0.29▲ 77.95±0.09▲

2.3 腦組織乳酸含量 模型組腦組織乳酸含量較假手術(shù)組升高(P＜0.05);PC低、中、高劑量組腦組織乳酸含量均較模型組降低(P＜0.05)。見表2。

2.4 能量代謝酶活性的改變 Na+-K+-ATPase活性:模型組Na+-K+-ATPase的活性較假手術(shù)組降低(P＜0.05);PC中、高劑量組較模型組升高(P＜0.05);PC中、高劑量組間無顯著差異(P＞0.05);PC低劑量組與模型組相比無顯著差異(P＞0.05)。Ca2+-ATPase活性:模型組 Ca2+-ATPase活性較假手術(shù)組降低(P＜0.05);PC高劑量組Ca2+-ATPase活性較模型組有所增高(P＜0.05)。見表2。

表2 PC對(duì)大鼠腦缺血再灌注時(shí)乳酸含量,Na+-K+-ATPase,Ca2+-ATPase活性的影響 (±s,n=8)

表2 PC對(duì)大鼠腦缺血再灌注時(shí)乳酸含量,Na+-K+-ATPase,Ca2+-ATPase活性的影響 (±s,n=8)

注:與假手術(shù)組比較,*P＜0.05,與模型組比較,▲P＜0.05

組別 PC劑量(mg/kg)乳酸含量(mmol/gprot)Na+-K+-ATPase活性(μmolPi/mgprot?h)Ca2+-ATPase活性(μmolPi/mgprot?h)假手術(shù)組 0 9.78±1.38 6.89±0.74 4.10±1.06模型組 0 27.67±5.08* 3.24±1.03* 2.07±0.36*PC低劑量組 50 22.30±1.80▲ 3.48±1.02 2.29±0.40 PC中劑量組 100 18.10±1.49▲ 4.65±0.78▲ 2.45±0.31 PC高劑量組 200 14.15±2.22▲ 5.13±0.71▲ 3.06±0.24▲

3 討論

大鼠大腦中動(dòng)脈的解剖分布及基底節(jié)的血液供應(yīng)與人類相似,本實(shí)驗(yàn)中使用大鼠局灶性腦缺血模型模擬人類腦缺血時(shí)的血流再通情況,并對(duì)方法稍加改進(jìn),將栓線由頸外動(dòng)脈插入改為由頸總動(dòng)脈插入,并將栓線頭部用蚊香燒成圓球狀,以減少對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管壁的損傷,操作方便,成本低廉,成功率高,更接近于人類局灶腦缺血后的病理狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)中對(duì)腦缺血大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分,可作為篩選模型制備的成功與否,又可反映腦缺血損傷的病理生理過程。

在腦組織缺血缺氧時(shí),無氧糖酵解增強(qiáng),生成大量的乳酸,使組織內(nèi)的p H值降低或產(chǎn)生酸中毒,導(dǎo)致細(xì)胞周圍H+增高,后者又可促發(fā) Na+-H+交換,使更多的 Na+流入細(xì)胞內(nèi),加重細(xì)胞水腫。此外,認(rèn)為高濃度H+可使蛋白質(zhì)變性,并改變了那些p H依賴性酶的活性,抑制NADH的再氧化和神經(jīng)遞質(zhì)的再攝取,促使自由基的形成。高濃度的H+還可使溶酶體通透性增加,甚至破裂引起了溶酶體中水解酶的釋放,加重了神經(jīng)元的損傷。有研究表明,腦缺血(再灌注)時(shí)組織中乳酸濃度的高低與腦組織損傷的程度呈正相關(guān)[10]。

腦的代謝完全依賴于血液中氧供及能量的及時(shí)恢復(fù),大腦血流量的中斷,能量貯存枯竭能夠?qū)е录毙源x紊亂。能量代謝的主要產(chǎn)物ATP的缺失是導(dǎo)致細(xì)胞死亡的關(guān)鍵因素。而ATP是維持Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase離子泵的主要能源,在腦缺血再灌注損傷時(shí),腦組織內(nèi)ATP含量的不足,使 Na+-K+ATPase和 Ca2+ATPase活性受到嚴(yán)重抑制?，F(xiàn)代研究表明,Na+-K+-ATPase對(duì)缺血再灌注損傷十分敏感,其損傷與再灌注期間的病理改變有密切的關(guān)系,Na+-K+-ATPase活性的降低可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)外Na+和K+梯度不能維持,引起細(xì)胞內(nèi) Na+增多,使細(xì)胞膜除極,從而引起鈣內(nèi)流及谷氨酸受體介導(dǎo)的一系列損傷機(jī)制的相繼發(fā)生,也是再灌注早期腦水腫形成的原因之一;同時(shí)細(xì)胞外K+增多,可使細(xì)胞膜持續(xù)去極化而影響興奮傳導(dǎo)、遞質(zhì)釋放等,并且與缺血期間所發(fā)生的細(xì)胞自殺現(xiàn)象相關(guān),影響腦恢復(fù)的質(zhì)量[11]。

Ca2+-A TPase主要調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的鈣離子平衡,當(dāng)其活性降低時(shí),細(xì)胞內(nèi)的Ca2+增多,引起鈣超載現(xiàn)象,導(dǎo)致神經(jīng)損傷機(jī)制的發(fā)生。因此,保護(hù)再灌注期間Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性對(duì)阻抑腦再灌注損傷的發(fā)生和發(fā)展有重要意義。

本研究中,在腦缺血期間,大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分值升高,腦水腫加強(qiáng),乳酸的含量增加,Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性降低,而使用PC能夠保護(hù)神經(jīng)功能,降低腦水腫的發(fā)生,降低乳酸含量,增加Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性,尤其是使用100、200 mg/kg PC劑量時(shí)效果較為顯著。以上結(jié)果表明,PC可有效減輕大鼠腦缺血-再灌注的損傷,從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,其機(jī)制可能與其減輕腦水腫、改善腦組織的代謝障礙有關(guān)。

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