桃葉衛(wèi)矛莖尖超低溫保存及再生

李　享， 蘇　晴， 宋　紅

(1.東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040； 2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150030)

桃葉衛(wèi)矛(EuonymusbungeanusMaxim)不僅是華北地區(qū)良好的園林綠化觀賞樹種，而且在工業(yè)、食品、醫(yī)療等方面也具有一定的應(yīng)用價(jià)值。為了能對(duì)桃葉衛(wèi)矛的應(yīng)用潛力有進(jìn)一步的開發(fā)利用，對(duì)其種質(zhì)資源的保護(hù)勢(shì)在必行。

常規(guī)的離體保存須要經(jīng)常繼代，耗費(fèi)大量人力、物力，而且易污染和變異。而玻璃化法超低溫保存具有操作簡(jiǎn)單、效果和重演性好等優(yōu)點(diǎn)[1-2]，是目前較為理想的植物種質(zhì)資源長(zhǎng)期穩(wěn)定的保存方法。另外莖尖具有良好的分生能力，因此目前已經(jīng)廣泛地將其應(yīng)用于植物種質(zhì)資源的離體保存，同時(shí)玻璃化法是目前國(guó)內(nèi)莖尖超低溫保存采用的主要方法，在胚狀體、懸浮細(xì)胞、原生質(zhì)體的超低溫保存中也有所報(bào)道[3-5]。尹明華等采用包埋玻璃化法對(duì)江西山藥(DioscoreaoppositaThunb.)莖尖進(jìn)行超低溫保存并對(duì)其遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)[6]。張艷秋等對(duì)菊花(Dendranthemamorifolium)莖尖玻璃化法超低溫保存技術(shù)進(jìn)行了研究[7]。韓麗對(duì)菊芋(Helianthustuberosus)品種莖尖超低溫保存進(jìn)行了研究，最終建立了菊芋莖尖超低溫保存體系[8]。本試驗(yàn)以桃葉衛(wèi)矛為研究材料，選用莖尖作為外植體進(jìn)行超低溫保存，以期探索桃葉衛(wèi)矛種質(zhì)資源保存的新途徑。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所采用的材料為桃葉衛(wèi)矛的莖尖，采自東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院苗圃內(nèi)3年生桃葉衛(wèi)矛樹。

1.2　試驗(yàn)方法

1.2.1超低溫保存方法無(wú)菌條件下剝?nèi)￠L(zhǎng)度分別為1～2、2～3、3～5 mm的無(wú)菌組培苗的莖尖，分別放入裝有不同濃度(0.1～0.5 mol/L)的蔗糖中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)環(huán)境條件為25 ℃暗培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為0、1、2、3 d。莖尖經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)處理后再用無(wú)菌牙簽將莖尖挑入裝有Loading溶液的冷凍管中，室溫下裝載0、10、20、30 min。然后轉(zhuǎn)入在玻璃化溶液PVS2中，在0 ℃冰盒中處理0、20、40、60 min后投入液氮中保存。有文獻(xiàn)顯示，保存1 d和保存10個(gè)月的櫻桃(Cerasuspseudocerasus)在保存效果上沒有明顯區(qū)別[9]。而莖尖在液氮中保存1 h以上后，其保存時(shí)間將不再影響保存效果，因此本試驗(yàn)中選擇保存 1 h。

1.2.2化凍、再培養(yǎng)將裝有莖尖的冷凍管從液氮中撈出后迅速投入40 ℃水浴鍋中化凍70 s，然后轉(zhuǎn)入U(xiǎn)ploading溶液中處理0、10、20、30 min，洗滌過(guò)程在無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行。后接種在不同的恢復(fù)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為先在25 ℃人工氣候箱中暗培養(yǎng)7 d，然后轉(zhuǎn)入組培苗培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的配比將恢復(fù)培養(yǎng)基設(shè)置為：(1)MS；(2)MS+1.0 mg/L 6-BA；(3)MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。

1.3　試驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理與分析

正交試驗(yàn)采用Minitab進(jìn)行設(shè)計(jì)，并利用Microsoft Office Excel 2007和SPSS 20.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、分析以及制圖。

2　結(jié)果與分析

2.1　桃葉衛(wèi)矛莖尖長(zhǎng)度對(duì)超低溫保存后莖尖成活率的影響

在桃葉衛(wèi)矛莖尖剝離的過(guò)程中，通過(guò)體視顯微鏡可以觀察到桃葉衛(wèi)矛莖尖部位是對(duì)稱型，因此在剝離過(guò)程中可以依據(jù)所剩幼葉的對(duì)數(shù)來(lái)確定莖尖長(zhǎng)度。本次試驗(yàn)中共設(shè)置1～2 mm(不包含葉原基)、2～3 mm(包含1對(duì)葉原基)、3～5 mm(包含2對(duì)葉原基)3個(gè)梯度。試驗(yàn)結(jié)果表明，桃葉衛(wèi)矛莖尖長(zhǎng)度對(duì)超低溫保存后莖尖成活率有顯著影響。當(dāng)莖尖長(zhǎng)度為2～3 mm時(shí)，超低溫保存后莖尖成活率可達(dá)83.33%，遠(yuǎn)大于長(zhǎng)度為1～2、3～5 mm的莖尖(圖1)。當(dāng)莖尖長(zhǎng)度為1～2 mm 時(shí)，由于莖尖分生組織外面沒有幼葉包被，使得分生組織承受較大損害，最終失活；而當(dāng)莖尖長(zhǎng)度為3～5 mm時(shí)，雖然莖尖分生組織得到良好的保護(hù)，但是由于莖尖體積過(guò)大，導(dǎo)致在玻璃化過(guò)程中莖尖分生組織部位脫水不徹底，進(jìn)而使得在超低溫保存過(guò)程中形成結(jié)晶破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最終使得莖尖失活。

2.2　預(yù)培養(yǎng)液蔗糖濃度對(duì)超低溫保存后莖尖成活率的影響

將剝離的莖尖放入不同蔗糖濃度的預(yù)培養(yǎng)液中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)后，莖尖經(jīng)過(guò)超低溫保存后的成活率各有不同，試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。當(dāng)蔗糖濃度在0.1～0.2 mol/L范圍內(nèi)時(shí)，超低溫保存后莖尖的成活率不足10%；而隨著蔗糖濃度的進(jìn)一步升高，莖尖成活率逐漸增加；當(dāng)蔗糖濃度增至0.4 mol/L時(shí)，莖尖成活率最高可達(dá)60%；當(dāng)蔗糖濃度為0.5 mol/L時(shí)，莖尖成活率降至10%。由此可以看出，預(yù)培養(yǎng)液中蔗糖濃度過(guò)低或過(guò)高都會(huì)導(dǎo)致莖尖成活率不高。

2.3　預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)超低溫保存后莖尖成活率的影響

將莖尖放入0.4 mol/L蔗糖預(yù)培養(yǎng)液中培養(yǎng)不同時(shí)間，超低溫保存后莖尖成活率如圖3所示。當(dāng)莖尖未經(jīng)預(yù)培養(yǎng)階段直接進(jìn)行下一程序時(shí)，莖尖全部失活，由此可知，桃葉衛(wèi)矛莖尖超低溫保存中預(yù)培養(yǎng)步驟是至關(guān)重要的；隨著預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的增加，莖尖成活率呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為2 d時(shí)，莖尖成活率升至最高，可達(dá)66.67%；而隨著預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，莖尖成活率出現(xiàn)下降趨勢(shì)，當(dāng)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為3 d時(shí)，莖尖成活率下降26.67百分點(diǎn)。由此可知，最佳的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為2 d。

2.4　裝載液處理時(shí)間對(duì)超低溫保存后莖尖成活率的影響

為了減少PVS2對(duì)莖尖的損害，所以采用2 mol/L丙三醇(甘油)+0.4 mol/L蔗糖組成的裝載液對(duì)莖尖進(jìn)行處理，裝載液處理時(shí)間對(duì)超低溫保存后莖尖成活率的影響如圖4所示。結(jié)果表明，莖尖經(jīng)過(guò)裝載液處理和對(duì)照組之間存在顯著差異，當(dāng)莖尖不經(jīng)裝載液處理直接進(jìn)行PVS2脫水處理時(shí)，莖尖成活率僅為6%；當(dāng)裝載液處理時(shí)間為10 min時(shí)，莖尖成活率可達(dá)70%；而隨著裝載時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，處理10 min的成活率與處理20、40 min的結(jié)果沒有顯著性差異，因此裝載液最佳處理時(shí)間為10 min。

2.5　PVS2溶液處理時(shí)間對(duì)超低溫保存后莖尖成活率的影響

PVS2溶液具有良好的脫水效果，它可以緩慢滲入植物材料，使植物組織脫去水分呈玻璃化狀態(tài)，從而在超低溫環(huán)境下保護(hù)植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)不受損害。但由于PVS2溶液中含有二甲基亞砜等有毒物質(zhì)，會(huì)對(duì)植物組織造成損害，因此在對(duì)植物材料進(jìn)行PVS2脫水處理時(shí)，須要嚴(yán)格控制處理時(shí)間。本次試驗(yàn)將裝載液處理過(guò)的莖尖轉(zhuǎn)入裝有PVS2溶液的冷凍管中并于0 ℃環(huán)境下處理不同時(shí)間，莖尖成活率如圖5所示。當(dāng)莖尖未經(jīng)PVS2溶液處理直接投入液氮中保存后，莖尖在恢復(fù)培養(yǎng)時(shí)全部失活變白；當(dāng)PVS2處理時(shí)間為60 min時(shí)，莖尖成活率最高可達(dá)73.3%，而當(dāng)處理時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)至80 min時(shí)，成活率降低至50%。

2.6　卸載液處理時(shí)間對(duì)超低溫保存后莖尖成活率的影響

當(dāng)莖尖從液氮中取出化凍后，為了避免PVS2溶液對(duì)莖尖造成二次毒害，所以應(yīng)立即對(duì)莖尖進(jìn)行洗滌。卸載液中高濃度的蔗糖有助于去除莖尖外部殘留的PVS2溶液，減少莖尖受到的毒害，提高成活率。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)不經(jīng)過(guò)卸載液處理的莖尖直接進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)時(shí)，莖尖全部死亡，說(shuō)明莖尖外部仍有殘留的PVS2溶液；利用含1.2 mol/L蔗糖的MS鹽溶液對(duì)化凍后的莖尖洗滌10 min后，莖尖成活率可達(dá)80%以上，洗滌時(shí)間對(duì)莖尖成活率的影響不顯著(圖6)。

2.7　恢復(fù)培養(yǎng)基對(duì)超低溫保存后莖尖成活率的影響

經(jīng)過(guò)卸載液洗滌后的莖尖應(yīng)立即轉(zhuǎn)入預(yù)先配制的恢復(fù)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，本試驗(yàn)中共設(shè)置3種不同的恢復(fù)培養(yǎng)基。結(jié)果(表1)表明，莖尖在不添加激素的培養(yǎng)基中的成活率低于添加激素的培養(yǎng)基；此外還可以看出，在只添加6-BA的恢復(fù)培養(yǎng)基中，莖尖恢復(fù)效果優(yōu)于添加6-BA和NAA的恢復(fù)培養(yǎng)基，由此可知6-BA對(duì)于超低溫保存后莖尖成活率具有顯著影響。

表1　恢復(fù)培養(yǎng)基對(duì)超低溫保存后莖尖成活率的影響

3　討論

莖尖的剝離是獲得莖尖超低溫保存材料的必經(jīng)途徑。莖尖剝離時(shí)，莖尖長(zhǎng)度直接影響莖尖超低溫保存后的成活率。試驗(yàn)結(jié)果表明，長(zhǎng)度為1～2、3～5 mm的莖尖超低溫保存后的成活率遠(yuǎn)小于長(zhǎng)度為2～3 mm的莖尖，這與王貞等在研究扶芳藤(Euonymusfortunei)莖尖玻璃化超低溫保存時(shí)的研究結(jié)果[10]一致。原因在于莖尖長(zhǎng)度過(guò)小時(shí)雖然脫水程度徹底，但成活率低；而莖尖長(zhǎng)度過(guò)長(zhǎng)又會(huì)使細(xì)胞內(nèi)殘留水分，進(jìn)而在液氮中形成冰晶破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，影響最終成活率。由此可見，適當(dāng)?shù)那o尖長(zhǎng)度是影響莖尖超低溫保存的重要因素之一。

莖尖預(yù)處理是為了提高莖尖對(duì)超低溫環(huán)境的耐受性。常見的預(yù)處理方式主要有低溫鍛煉和預(yù)培養(yǎng)。低溫鍛煉主要是針對(duì)莖尖取自無(wú)菌苗的試驗(yàn)，由于本試驗(yàn)中莖尖取自實(shí)生苗，所以僅對(duì)莖尖進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳的預(yù)培養(yǎng)方式為將莖尖投入蔗糖濃度為0.4 mol/L的MS鹽溶液中暗培養(yǎng)2 d。前人研究表明，預(yù)培養(yǎng)對(duì)提高植物材料超低溫保存的成活率具有很大的影響[11]。王貞等在研究扶芳藤莖尖玻璃化超低溫保存時(shí)對(duì)莖尖直接進(jìn)行裝載液處理[10]，而韓麗在研究菊芋品種莖尖超低溫保存時(shí)用含有0.4 mol/L蔗糖的液體MS培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)3 d，2種植物的莖尖超低溫保存后的效果均表現(xiàn)良好[8]，所以針對(duì)不同的植物是否需要莖尖預(yù)處理以及如何處理是因植物材料而異的。

裝載液處理是為了進(jìn)一步降低細(xì)胞內(nèi)自由水的含量，平衡細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓。本試驗(yàn)采用含2 mol/L甘油和 0.4 mol/L 蔗糖的MS鹽溶液裝載10 min，結(jié)果表明，莖尖成活率為70%左右，而對(duì)于不經(jīng)過(guò)裝載液處理的試驗(yàn)組，莖尖最終全部死亡，由此可見，裝載階段對(duì)于桃葉衛(wèi)矛莖尖超低溫保存具有顯著影響。

利用PVS2溶液對(duì)莖尖進(jìn)行脫水處理是莖尖超低溫保存過(guò)程中的關(guān)鍵步驟。由于PVS2溶液中的二甲基亞砜(DMSO)既是一種滲透性保護(hù)劑，又存在一定的毒性作用，因此，探究PVS2溶液處理時(shí)間對(duì)超低溫保存后莖尖成活率的影響是必不可少的。Sakai等的研究表明，莖尖在0 ℃條件下與PVS2溶液接觸所受到的毒害要小于在25 ℃條件下所受毒害[5]，因此本試驗(yàn)研究了0 ℃條件下利用PVS2溶液對(duì)桃葉衛(wèi)矛莖尖處理不同時(shí)間，結(jié)果顯示，適當(dāng)?shù)腜VS2溶液處理時(shí)間對(duì)超低溫保存后莖尖成活率影響較大，在0～60 min 內(nèi)，隨著PVS2溶液處理時(shí)間的延長(zhǎng)，莖尖成活率在逐漸升高，并在60 min時(shí)莖尖成活率達(dá)到最高；當(dāng)處理時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)時(shí)，莖尖受到的毒性也在不斷增大，使得莖尖成活率開始下降。不同植物莖尖進(jìn)行PVS2溶液脫水處理的時(shí)間也各有不同，如柑橘(CitrusreticulataBlanco)莖尖超低溫保存中PVS2處理時(shí)間為60 min[12]，另外菊花[13]和白苜蓿草(Trifoliumrepens)[14]經(jīng)過(guò)PVS2處理15 min，歐洲板栗(Castaneasativa)經(jīng)過(guò)PVS2處理120 min才能達(dá)到最高存活率[15]，Niino等認(rèn)為處理時(shí)間與材料的大小也有關(guān)系[16]。

莖尖從液氮中取出并化凍，由于仍然處于PVS2溶液中，此時(shí)如果直接將莖尖接種在恢復(fù)培養(yǎng)基上，那么殘留的PVS2溶液會(huì)繼續(xù)對(duì)莖尖造成毒害。因此，須要使用卸載液對(duì)莖尖進(jìn)行洗滌。本試驗(yàn)研究了不同洗滌時(shí)間對(duì)莖尖成活率的影響，結(jié)果表明，對(duì)于桃葉衛(wèi)矛莖尖最佳的洗滌方法為 25 ℃ 條件下用含1.2 mol/L蔗糖的MS鹽溶液洗滌10 min，莖尖成活率可達(dá)80%以上。石茹等研究發(fā)現(xiàn)的最佳洗滌方法為用含1.2 mol/L蔗糖的MS鹽溶液在20～25 ℃條件下洗滌2～3次，每次10 min。

將莖尖接種于培養(yǎng)基上進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)，是檢測(cè)莖尖超低溫保存效果的直接而高效的方法，而恢復(fù)培養(yǎng)的環(huán)境條件以及培養(yǎng)基的配方對(duì)于莖尖能否成活顯得尤為重要。在恢復(fù)培養(yǎng)的條件下，在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)當(dāng)莖尖處于正常光照條件下時(shí)，全部變白死亡。因此參照矮牽牛(Petuniahybrida)莖尖超低溫保存恢復(fù)培養(yǎng)過(guò)程中的方法[17]，先將莖尖放入人工氣候箱中，25 ℃ 條件下暗培養(yǎng)7 d后，轉(zhuǎn)入正常光照條件下培養(yǎng)，7 d 后發(fā)現(xiàn)莖尖開始逐漸變綠。而對(duì)于恢復(fù)培養(yǎng)基的配方，本試驗(yàn)共設(shè)置了3組培養(yǎng)基，試驗(yàn)結(jié)果表明，莖尖在含有 1.0 mg/L 6-BA 的MS培養(yǎng)基上成活率較高，因此桃葉衛(wèi)矛莖尖超低溫保存后恢復(fù)培養(yǎng)最佳方案為：在MS+1.0 mg/L 6-BA 培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)入正常光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

4　結(jié)論

本研究建立了桃葉衛(wèi)矛莖尖超低溫保存體系(圖7)。結(jié)果表明，桃葉衛(wèi)矛莖尖超低溫保存中莖尖最適長(zhǎng)度為2～3 mm；在預(yù)培養(yǎng)階段，預(yù)培養(yǎng)液中蔗糖最適濃度為 0.4 mol/L，最佳預(yù)處理時(shí)間為2 d；在裝載液處理階段，最佳裝載時(shí)間為10 min；在PVS2溶液處理階段，最佳處理時(shí)間為60 min；在卸載液處理階段，最佳處理時(shí)間為10 min；當(dāng)莖尖洗滌完畢后應(yīng)將其接種于6-BA 1.0 mg/L的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為暗培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)入正常光照下進(jìn)行培養(yǎng)，莖尖成活率可達(dá)70%以上。隨后再利用莖尖組織培養(yǎng)體系將其培養(yǎng)成苗。

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