現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)微生態(tài)群落的研究進(jìn)展

高傳慶 張鈞利 潘康成

（①山東省濱州市畜牧獸醫(yī)局 256600 ②江蘇無(wú)錫阿爾寶爾生物工程有限公司③四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

動(dòng)物消化道內(nèi)的微生物群落是一個(gè)極其復(fù)雜的生物群體，包含有超過(guò)400種的細(xì)菌類別，其數(shù)量隨年齡、環(huán)境等條件的變化而產(chǎn)生變化。傳統(tǒng)的微生物群落多樣性及結(jié)構(gòu)分析是以純培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)，通過(guò)微生物形態(tài)及生理生化特征等表型分析。目前，由于受到培養(yǎng)條件的限制，只能培養(yǎng)與鑒定出約20%～40%的細(xì)菌，對(duì)這些存活但不可培養(yǎng)的微生物研究成為制約微生態(tài)學(xué)發(fā)展的瓶頸。另外，傳統(tǒng)的分離計(jì)數(shù)也難以滿足對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的需求。分子微生態(tài)學(xué)依據(jù)樣品中微生物核苷酸序列的不同，分析其種類和相對(duì)數(shù)量，揭示微生物種類組成以及種群數(shù)量情況，從而對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)得到一個(gè)比較客觀、全面的認(rèn)識(shí)。這種研究方法不受純培養(yǎng)的限制，而且速度快、提供的信息量大，因而特別適合于對(duì)消化道微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行連續(xù)動(dòng)態(tài)分析，達(dá)到解析群落結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系、實(shí)現(xiàn)對(duì)群落功能定向調(diào)控的目的。

1 熒光原位雜交技術(shù)

FISH是根據(jù)16S或23S rRNA上相應(yīng)于特定微生物類群的特異性序列設(shè)計(jì)專一性探針，對(duì)樣品進(jìn)行全細(xì)胞熒光原位雜交，利用熒光顯微鏡對(duì)所標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)的一種微生物分析技術(shù)，該技術(shù)建立在敏感度極高、不同顏色熒光標(biāo)記基礎(chǔ)上的原位分析法。這種雜交方法的目標(biāo)rRNA主要存在于活細(xì)胞中，因此可以對(duì)特定類群的微生物活細(xì)胞進(jìn)行定量描述。目前該技術(shù)多用于環(huán)境中特定微生物種群鑒定、種群數(shù)量分析、特異微生物跟蹤檢測(cè)、微生物的空間定位等。Asfie等用該技術(shù)研究金魚(yú)排泄物菌群結(jié)構(gòu)的組成，發(fā)現(xiàn)氣單胞菌屬是金魚(yú)消化道的主要菌群。Salzman等利用FISH技術(shù)檢測(cè)小鼠腸道菌群，結(jié)果有25%的菌群序列為已描述的細(xì)菌，75%為未描述的新細(xì)菌序列，通過(guò)設(shè)計(jì)的探針與結(jié)合其它方法可以確定大約80%的大腸內(nèi)細(xì)菌和71%的盲腸細(xì)菌。Kenji等研究大鼠口服乳酸菌后采用FISH檢測(cè)鼠李糖乳桿菌、乳酸乳球菌和植物乳桿菌數(shù)量變化，結(jié)果，口服乳酸菌后的這些細(xì)菌數(shù)量在腸道中得到升高，而給予葡聚糖后的大鼠發(fā)生腹瀉和這些細(xì)菌數(shù)量大量下降。

雖然FISH技術(shù)在環(huán)境樣品中微生物多樣性、污水處理相關(guān)微生物多樣性、內(nèi)共生微生物多樣性以及醫(yī)學(xué)微生物口腔、腸胃、呼吸道菌群多樣性研究中得到了廣泛的應(yīng)用，但該技術(shù)的應(yīng)用要受到環(huán)境樣品微生物生理狀態(tài)的影響，如芽孢、放線菌及休眠時(shí)期細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性降低、以及細(xì)菌在繁殖過(guò)程中熒光基因可能發(fā)生變化的情況都會(huì)影響群落中部分種屬豐度的正確估計(jì)，而且不能檢測(cè)出環(huán)境樣品中的未知種屬。再則，F(xiàn)ISH技術(shù)定量的手段還停留在熒光顯微鏡下的人工計(jì)數(shù)階段，這不僅費(fèi)時(shí)，而且雜交細(xì)胞的數(shù)量?jī)H限于幾千個(gè)，數(shù)量有限，微生物定量的準(zhǔn)確性依賴于樣品的處理和多個(gè)視野計(jì)數(shù)的平均，這些因素限制了它的廣泛應(yīng)用。

2 脈沖場(chǎng)凝膠電泳

PFGE的基本原理是利用電泳脈沖系統(tǒng)通過(guò)瓊脂糖凝膠分離大片段的DNA，即用限制性內(nèi)切酶將分離物的基因組消解成相對(duì)小的大片段后，用脈沖場(chǎng)凝膠電泳將它們分開(kāi)，從而獲得DNA片段的指紋圖，通過(guò)計(jì)算機(jī)凝膠掃描、軟件分析，建立對(duì)所有微生物的PFGE圖譜的數(shù)據(jù)庫(kù)，以便各菌株間的比較。該技術(shù)可以分離大小為50～1000 kb的DNA片段，甚至可以觀察整個(gè)染色體，可用于分離細(xì)菌染色體等大分子DNA。PFGE已經(jīng)成功的應(yīng)用于分析不同細(xì)菌中的染色體構(gòu)成，同時(shí)結(jié)合特異性的酶切技術(shù)用于菌種間或同一菌種不同菌株的鑒定。此外，它還可以為判斷基因組的大小和基因圖譜的建立提供有用的資料。PFGE對(duì)特異的菌有特征性，步驟簡(jiǎn)單，具有高分辨力，且結(jié)果易于分析。Kimura等應(yīng)用此技術(shù)對(duì)人糞便樣品檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在人的糞便中乳桿菌和雙歧桿菌為主要菌群。O’Riordan等應(yīng)用PFGE結(jié)合限制性酶用于雙歧桿菌種間及菌株間的鑒定，盡管PFGE技術(shù)在菌株間的鑒定具有很大的潛力，但對(duì)細(xì)菌菌株的分類鑒別是沒(méi)有價(jià)值的。該技術(shù)耗時(shí)較長(zhǎng)，一般需要5d～7d才能完成，這樣大大降低了實(shí)驗(yàn)室分析大量樣品的能力，使其應(yīng)用受到限制。

3 ERIC-PCR技術(shù)

1990年，Sharples等在對(duì)E. coli基因組進(jìn)行分析時(shí)，首次發(fā)現(xiàn)了ERIC片段，名命為“基因間重復(fù)單位”序列（IRU）。隨后，Hulton等研究發(fā)現(xiàn)腸桿菌基因間也有這樣的保守重復(fù)序列，并命名為Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus (ERIC)，ERIC的中心有段保守性很高的反向重復(fù)序列，該序列長(zhǎng)約44bp。Versalovic等以ERIC的核心序列設(shè)計(jì)一對(duì)反向引物，認(rèn)為ERIC-PCR擴(kuò)增是兩個(gè)相鄰的ERIC保守序列之間的區(qū)域，由于不同的細(xì)菌基因組上的ERIC重復(fù)序列的數(shù)目和分布不同，從而得到一系列大小不同片段組成的DNA指紋圖譜，并將該技術(shù)申報(bào)專利。此后，ERIC-PCR技術(shù)被廣泛用于細(xì)菌分類和菌種鑒別上。該方法可直接根據(jù)樣品ERIC條帶的分布、數(shù)量和亮度等信息去分析腸道樣品中菌群結(jié)構(gòu)和種群變化，該法快速、簡(jiǎn)潔、不依賴純培養(yǎng)。Di Giovanni等首次報(bào)道將ERIC-PCR應(yīng)用到混合菌群群落結(jié)構(gòu)的分析研究上，得到能反映菌群組成差異的重復(fù)性好且穩(wěn)定的指紋圖譜，在研究混合菌體系時(shí)，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于RAPD方法，更穩(wěn)定，重復(fù)性更好，而且具備RAPD不要求模板序列已知而直接進(jìn)行擴(kuò)增的優(yōu)點(diǎn)。目前該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)人和動(dòng)物的腸道菌結(jié)構(gòu)和多樣性。由于ERIC-PCR之后都采用瓊脂糖進(jìn)行電泳分析其條帶，其電泳分辨率較低，在不同系統(tǒng)中有很多條帶具有相同的電泳特性但其序列組成信息不同，可能造成一些腸道菌群的漏檢，Yang等進(jìn)行ERIC-PCR后采用變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析，可顯著提高其分辨率。

4 PCR-DGGE方法

DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)是利用序列不同的DNA片段解鏈溫度不同的原理，通過(guò)梯度變性膠將DNA分離開(kāi)來(lái)的電泳系統(tǒng)。在含有尿素和甲酰胺的濃度線性遞增的聚丙烯酰胺凝膠電泳中，部分解鏈的雙鏈DNA分子的電泳遷移率下降。在雙鏈DNA分子中，AT堿基之間有2個(gè)氫鍵，而GC之間有3個(gè)氫鍵，因此AT堿基對(duì)變性劑的耐受性低于GC堿基對(duì)。由于這四種堿基的組成和排列差異，使不同序列的雙鏈DNA分子具有不同的解鏈溫度。在電場(chǎng)的作用下，當(dāng)某一雙鏈DNA序列遷移到變性凝膠的一定位置，并達(dá)到其解鏈溫度時(shí)，即開(kāi)始部分解鏈，解鏈程度越大，遷移阻力越大，DNA分子的遷移速度隨之減小，產(chǎn)生的遷移阻力與電場(chǎng)力相平衡時(shí)，具有不同序列的DNA片段則停留于凝膠的不同位置，結(jié)束電泳時(shí)，形成相互分開(kāi)的條帶圖譜。

DGGE最早由Fischer和Lerman發(fā)明，并用于檢測(cè)DNA突變。Muyzer等首次用于分析土壤環(huán)境的微生物區(qū)系以來(lái)，DGGE已成為檢測(cè)環(huán)境微生物群落多態(tài)性的一種可靠方法。用DGGE進(jìn)行微生態(tài)研究時(shí)，根據(jù)細(xì)菌16Sr RNA基因序列中可變區(qū)的堿基順序，選擇與可變區(qū)（如V3或V6-V8區(qū)）配對(duì)的引物，擴(kuò)增出細(xì)菌16S rRNA基因的部分序列，并通過(guò)DGGE得到分離，電泳條帶的數(shù)目、位置和強(qiáng)度可辨別出樣品中微生物的種類及細(xì)菌的相對(duì)構(gòu)成比例，得出不同樣本的微生物結(jié)構(gòu)及組成。為了使目的序列能夠完全解鏈，在PCR擴(kuò)增目的片段時(shí)，在引物的一端人為摻入一段約40個(gè)堿基的GC序列用以調(diào)節(jié)目的序列的解鏈行為，可使對(duì)核酸片段序列差異的敏感度提高1倍。

PCR-DGGE技術(shù)本身的局限性不容忽視，例如核酸提取的片面性、PCR反應(yīng)過(guò)程中形成的16S rDNA嵌合體序列及PCR反應(yīng)中對(duì)某些序列的優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增等。另外，DGGE只能分離較小的DNA片斷(達(dá)500bp)，較長(zhǎng)的片斷分離率下降，限制其用于系統(tǒng)發(fā)育分析和探針的序列信息數(shù)量，DGGE只能給出定性的結(jié)果，必須結(jié)合FISH進(jìn)行微生物的確認(rèn)和定量。理論上，只要選擇的電泳條件如變性劑梯度、電泳時(shí)間、電壓等足夠精細(xì)，最少可檢測(cè)到只有一個(gè)堿基差異的DNA片段，但是DGGE法并不能對(duì)樣品中所有的DNA片段進(jìn)行分離，在微生物群落中數(shù)量小于1%的種群不能很好地進(jìn)行分析；此外，不同的DGGE實(shí)驗(yàn)條件很可能導(dǎo)致不同的帶型譜圖，這無(wú)疑對(duì)序列信息的探針設(shè)計(jì)和系統(tǒng)發(fā)育分析也有一定的影響。盡管DGGE技術(shù)具有以上局限性，但因其重現(xiàn)性強(qiáng)、可靠性高、速度快，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品，能用于對(duì)微生物的動(dòng)態(tài)跟蹤觀察，且可以對(duì)特定條帶測(cè)序或利用探針雜交方法進(jìn)一步分析，能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法分析微生物群落的不足，已逐漸成為現(xiàn)代分子微生態(tài)學(xué)領(lǐng)域一種重要研究手段，并被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)動(dòng)物腸道中的菌群結(jié)構(gòu)和菌群的多樣性。

5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

RT-qPCR 是通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性的分析。RT-qPCR技術(shù)最早由Higuchi提出，當(dāng)時(shí)設(shè)想實(shí)時(shí)觀察PCR反應(yīng)的全過(guò)程，最終達(dá)到檢測(cè)樣品中的DNA量的目的。1995年美國(guó)PE公司成功研發(fā)了TaqMan技術(shù)，1996年又推出了首臺(tái)Real-time PCR檢測(cè)系統(tǒng)，使該技術(shù)得以應(yīng)用和推廣。RT-qPCR的化學(xué)原理包括熒光探針類和熒光嵌合類兩種。熒光探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，如Taqman探針、復(fù)合探針、分子信標(biāo)、雙雜交探針等，其中以前兩者最為常用。TaqMan探針?lè)ㄖ兴肨aqMan探針是一種寡核苷酸探針，它的熒光與目的序列擴(kuò)增相關(guān)。它設(shè)計(jì)為與目標(biāo)序列上游引物和下游引物之間的序列配對(duì)。探針的5'末端連接報(bào)告熒光基團(tuán)FAM（6-羧基熒光素），而3'末端則連接淬滅熒光基團(tuán)TAMRA（6-羧基四甲基若丹明）。當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對(duì)時(shí)，兩基團(tuán)之間構(gòu)成共振結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3'端的淬滅基團(tuán)接近而被淬滅。但在進(jìn)行PCR延伸反應(yīng)時(shí)，聚合酶的5’外切酶活性將探針進(jìn)行酶切，破壞了兩基團(tuán)間的共振結(jié)構(gòu)，使得熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，熒光信號(hào)得以釋放，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接受到熒光信號(hào)。DNA模板每復(fù)制一次，就有一個(gè)探針被水解，并釋放出熒光信號(hào)，理論上被釋放的熒光基團(tuán)數(shù)目與PCR產(chǎn)物數(shù)量是一對(duì)一的關(guān)系，光密度同釋放的熒光基團(tuán)數(shù)目成正比關(guān)系，因此對(duì)模板達(dá)到了準(zhǔn)確定量。目前，RT-qPCR的Taqman探針技術(shù)被認(rèn)為是腸道菌定量的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

該技術(shù)是對(duì)常規(guī)PCR技術(shù)的革新，其定量和擴(kuò)增同步進(jìn)行克服了PCR的平臺(tái)效應(yīng)；除加樣開(kāi)蓋外，其后完全是閉管操作，減少污染；不需PCR后處理，避免假陽(yáng)性；可直接監(jiān)測(cè)擴(kuò)增中熒光信號(hào)變化獲得定量結(jié)果，精確性和靈敏度高；檢測(cè)速度快，幾個(gè)反應(yīng)可同時(shí)進(jìn)行，多色熒光檢測(cè)；特異性和重復(fù)性強(qiáng)；應(yīng)用范圍廣。經(jīng)典的腸道菌群檢測(cè)方法只是檢測(cè)可培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)菌群，而RT-qPCR技術(shù)，還可以檢測(cè)不可培養(yǎng)的菌群，并且可以通過(guò)進(jìn)一步的定量分析來(lái)確定在具體腸道某一類有益菌和有害菌在腸道的定植規(guī)律，以及更深入研究它們對(duì)動(dòng)物健康狀況的影響。RT-qPCR技術(shù)能直接采用從糞便樣品中提取的細(xì)菌DNA來(lái)定量腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群和非優(yōu)勢(shì)菌群。因此，近年來(lái)，以16S rDNA基因?yàn)榛A(chǔ)的RTPCR已被成功用于腸道菌群結(jié)構(gòu)及細(xì)菌定量、病源檢測(cè)、基因表達(dá)分析等多個(gè)領(lǐng)域的研究，并日益顯出了它的優(yōu)越性。

6 結(jié)束語(yǔ)

上述幾種分子生物學(xué)方法已經(jīng)建立了比較成熟的技術(shù)，每一類方法都有自身的功能和局限性，也都在發(fā)展和完善當(dāng)中，并相互補(bǔ)充相互推動(dòng)。傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法積累了種群分類的大量數(shù)據(jù)，為生物標(biāo)記方法和現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)提供了良好的背景材料，在功能特性的認(rèn)識(shí)上有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。生物標(biāo)記方法可快速進(jìn)行單個(gè)環(huán)境微生物樣品的群落結(jié)構(gòu)和多樣性解析，但在定性上依賴于傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法?，F(xiàn)代分子生物學(xué)提高了解析的靈敏度，在基因水平上擴(kuò)大了物種多樣性的視野，其中基因指紋技術(shù)可同時(shí)分析多個(gè)樣品，直觀顯示了種群結(jié)構(gòu)變化情況，有助于分析調(diào)控因子對(duì)群落結(jié)構(gòu)和群落功能的影響。 分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展使微生物多樣性研究更直接，也給腸道微生物研究展示了一個(gè)革命性的前景。每種方法有各自的應(yīng)用特點(diǎn)，在腸道微生態(tài)的研究中，應(yīng)該根據(jù)不同的研究對(duì)象，采取不同的分子生物學(xué)方法或聯(lián)合應(yīng)用幾種方法才可能對(duì)腸道菌群有一個(gè)更全面的了解。