海藻糖的應(yīng)用及海藻糖酶的研究進(jìn)展

肖麗蓉 肖金樹 張友洪 周安蓮 黃蓋群 危玲

（四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，四川 南充 637000）

海藻糖(Trechalose)又稱酵母糖，是由兩個(gè)葡萄糖分子通過糖苷鍵結(jié)合而成的非還原性雙糖。最初由Wiggers等于1882年從黑麥的麥角菌中分離出來。后來發(fā)現(xiàn)它是一種廣泛存在于植物、細(xì)菌、真菌和無脊椎動(dòng)物體內(nèi)，尤其在霉菌、蘑菇等真菌中含量高，是國(guó)際上最近開發(fā)的主要低聚糖之一，在脫水、干旱、高溫、冷凍、高滲透壓及有毒試劑等不良環(huán)境條件下能保護(hù)生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定，維持生物體的正常生命活動(dòng)，是一天然的生命保護(hù)者，因此備受科學(xué)家的關(guān)注和研究。最新的研究表明，外源性的海藻糖具有良好的非特異性保護(hù)作用，因此有人把海藻糖稱為“生命之糖”。由于海藻糖穩(wěn)定的細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，海藻糖具有抗冷凍性、保濕性、耐高溫性、干燥抗性，非還原性，良好的加工特性，化學(xué)穩(wěn)定性，與其它糖類相比，更具安全性、非齲齒性及無異味性，優(yōu)質(zhì)甜味，低熱值，防齲齒等特性，它已在許多方面得以應(yīng)用，主要有以下幾個(gè)方面:

1 在食品工業(yè)上的應(yīng)用

1995年海藻糖在日本林原生物化學(xué)公司實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)，并首次作為食品添加劑上市銷售，產(chǎn)品種類包括糖果(蜜餞、口香糖、巧克力)、飲料、罐頭食品、糕點(diǎn)、加工后的水產(chǎn)品、冷凍食品。在日本，自上市后海藻糖的銷量已超過數(shù)千萬噸。1998年，在韓國(guó)和中國(guó)臺(tái)灣海藻糖也已獲準(zhǔn)作為食品添加劑使用，日本林原生化研究所申請(qǐng)了使用海藻糖的非油炸快餐食品制造法的專利。2000年10月美國(guó)FDA授予海藻糖為GRAS地位，批準(zhǔn)進(jìn)入食品各領(lǐng)域。2001年9月，歐盟批準(zhǔn)在其范圍內(nèi)使用。British Sugar公司推薦海藻糖在各種食品中使用。美國(guó)Cargill公司將海藻糖用于開發(fā)運(yùn)動(dòng)飲料。如今海藻糖的規(guī)范應(yīng)用正在歐洲掀起。

1.1 保護(hù)劑

使用淀粉的食品，易因淀粉的老化而變硬，出現(xiàn)松散、白濁等現(xiàn)象，從而引起品質(zhì)的下降，尤其是冷凍食品，淀粉的老化現(xiàn)象更為顯著。過去抑制淀粉老化主要采用添加糖類、酶制劑、乳化劑等方法，但只有添加糖較為有效。海藻糖防止淀粉老化的作用優(yōu)異，明顯優(yōu)于其他糖類，在有效地保護(hù)蛋白質(zhì)分子的天然結(jié)構(gòu)的同時(shí)，也保持了食品的質(zhì)地和風(fēng)味。目前已成功利用海藻糖干燥的食品有牛奶、咖啡、果汁等。用海藻糖溶液處理蔬菜、水果和肉類，能防止軟化，保持良好的組織和感官品質(zhì)，延長(zhǎng)產(chǎn)品的壽命。常用的化學(xué)防腐劑有一定的毒性，海藻糖能很好地防止異味和酸化且實(shí)驗(yàn)表明其對(duì)動(dòng)物無毒性。對(duì)于含脂肪及不飽和脂肪酸較多的食品，添加海藻糖也可有效抑制其酸敗。另外含海藻糖的食品的復(fù)水速度大大加快。很顯然，在海產(chǎn)品、農(nóng)產(chǎn)品等品質(zhì)的保持和運(yùn)輸、戰(zhàn)略儲(chǔ)備、冷藏費(fèi)用上都有著非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1.2 甜味劑

海藻糖甜度低，甜味爽口，不留后味，滲透壓與蔗糖相當(dāng)，現(xiàn)已有實(shí)驗(yàn)證明具有抗齲齒功能，可在食品中代替蔗糖使用，可作為保護(hù)牙齒食品的甜味劑，廣泛應(yīng)用于各種糖果、口香糖、糕點(diǎn)、飲料、調(diào)味品、冰淇淋、巧克力等，促進(jìn)食品工業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。國(guó)外已廣泛作為甜味劑、質(zhì)構(gòu)改良劑、穩(wěn)定劑、保濕劑和輔助用劑等廣泛應(yīng)用于焙烤食品、飲料、糖果、果醬及速食食品中，海藻糖在甜味劑食品領(lǐng)域也有著廣闊的應(yīng)用前景。

2 在醫(yī)藥行業(yè)和生物制品保護(hù)中的應(yīng)用

2.1 生物制品的保護(hù)劑

海藻糖具有獨(dú)特的保護(hù)生物分子的功能，是生物分子的特效保護(hù)劑和組織細(xì)胞的穩(wěn)定劑，它將為醫(yī)用生物制品，如血液制品、酶、菌苗、疫苗、病毒、激素、細(xì)胞膜、單克隆抗體、載藥脂質(zhì)體、抗血清、外科手術(shù)所需貯存的皮膚、器官、重組人體蛋白、離體細(xì)胞和組織及干PCR試劑盒等的干燥保存、運(yùn)輸和使用帶來極大的方便，且具有其它種類的保護(hù)劑都達(dá)不到保護(hù)效果。用海藻糖代替血漿作為生物制品的穩(wěn)定劑，不僅能使其可在常溫保存，還可減少因血液污染而引起的乙肝和愛滋病的傳播，保證生物制品的質(zhì)量和安全性。英國(guó)劍橋Quads'ant公司和WHO將進(jìn)行合作，利用海藻糖干燥脊髓灰質(zhì)炎疫苗，以解決從生產(chǎn)地到第三世界一些國(guó)家的長(zhǎng)途運(yùn)輸中的冷凍問題。據(jù)統(tǒng)計(jì)僅此一項(xiàng)即可節(jié)省數(shù)百萬美元的冷凍系統(tǒng)費(fèi)用，這也有助于實(shí)現(xiàn)2OO0年在全世界范圍內(nèi)消滅脊髓灰質(zhì)炎的目標(biāo)。美國(guó)科學(xué)家最近發(fā)明利用海藻糖在脫水狀態(tài)下長(zhǎng)期儲(chǔ)存血小板的新方法，可使儲(chǔ)存時(shí)間由幾天延長(zhǎng)到幾個(gè)月甚至幾年。研究人員已成功使血小板保存7個(gè)月之久。我國(guó)也開展了海藻糖對(duì)人血清酶抗凍結(jié)性保護(hù)研究和其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞保存中的作用機(jī)制及應(yīng)用研究。

2.2 活菌劑

活菌制劑是當(dāng)今保健品的開發(fā)熱點(diǎn)，但活菌在人體腸道內(nèi)的存活率難以保證，如果能用海藻糖作為干燥保護(hù)劑，制成具有較高活力的菌粉，再以只能在腸道溶解的材料包裝，生產(chǎn)出口服腸溶膠囊，將會(huì)大大提高活菌制劑的生物效價(jià)。此外，有資料稱，海藻糖能促進(jìn)人體雙歧桿菌增殖，改善腸道微生態(tài)環(huán)境；有抑制骨膠原分解的作用，可防止骨質(zhì)疏松；海藻糖具有較強(qiáng)的抗輻射作用，防止DNA突變；能夠顯著提高動(dòng)物的熱耐受性，具有防止肌肉疲勞，脈率過高，呼吸淺頻及出現(xiàn)低血壓狀態(tài)等作用，有利于在機(jī)體處于極端環(huán)境下向肌肉組織提供更多的氧，增加機(jī)體有氧代謝能力。

此外，海藻糖還可作為各種藥物的甜味劑，如:口服液、片劑、丸劑、漱口劑等。

3 在精細(xì)化工中的應(yīng)用

利用生物工程技術(shù)生產(chǎn)表面活性劑是七十年代后生物工程領(lǐng)域中發(fā)展起來的一個(gè)新課題。從目前的研究情況看，糖脂是最重要的一類生物表面活性劑。海藻糖脂具有良好的表面活性性能?？捎糜谑偷娜伍_采、日化、紡織等工業(yè)。另外，海藻糖基本上不被牙齒所帶的微生物發(fā)酵，可用作保護(hù)性增香劑；其結(jié)晶形式可與粘接劑如羥乙基淀粉等一起用作糖衣材料。

4 在化妝品中的應(yīng)用

由于海藻糖具有保濕、防曬、防紫外線功效，故可用于皮膚化妝品、洗面奶，作為保濕劑、保護(hù)劑、潔膚劑、紫外吸收劑等。還可用于唇膏、口腔清涼劑、口腔芳香劑等，作為甜味劑、改良劑?，F(xiàn)在，用于化妝品的主要是海藻糖的衍生物。日本已將其列為新規(guī)格化妝品原料，并用于高級(jí)化妝品中。日本林原生化研究所發(fā)現(xiàn)，海藻糖有抑制老年人體臭的功效，準(zhǔn)備利用海藻糖開發(fā)防止體臭的化妝品和護(hù)理用品。另外，無水海藻糖在化妝品方面的研究也成為一大熱點(diǎn)。

5 海藻糖基因工程方面的研究

5.1 作物育種方面

隨著現(xiàn)代基因工程技術(shù)的深入研究，可以將海藻糖合成酶基因?qū)胫参?，?gòu)建生產(chǎn)海藻糖的轉(zhuǎn)基因植物，培育抗凍、抗旱、抗寒、耐鹽轉(zhuǎn)基因植物新品種。現(xiàn)有報(bào)道把海藻糖合成酶基因?qū)胄←?、煙草中，都能明顯地提高抗逆性能。Jang等將大腸桿菌中兩種負(fù)責(zé)合成海藻糖的基因進(jìn)行融合后導(dǎo)入水稻中，這種轉(zhuǎn)基因水稻內(nèi)海藻糖的積累增加，在惡劣環(huán)境條件下的生存能力不僅比普通水稻更強(qiáng)，而且其生長(zhǎng)不被抑制。通過轉(zhuǎn)基因植物培育的高海藻糖含量植物不僅抗逆性提高，而且收獲后顯得更加新鮮，具有更濃郁的風(fēng)味，如檸檬、草莓等水果和蔬菜及其他農(nóng)產(chǎn)品，其商品價(jià)值明顯提高。目前英美科學(xué)家已使番茄積累海藻糖，并正在研究把基因引入其它水果。未來著重研究海藻糖積累與植物生長(zhǎng)發(fā)育之間的關(guān)系，以更好地研究糖與基因表達(dá)調(diào)控之間的關(guān)系，相信通過轉(zhuǎn)化海藻糖合成酶有關(guān)基因增加體內(nèi)海藻糖含量會(huì)成為作物抗逆品種選育的新方法。與此同時(shí)，使用海藻糖還可望解決干旱、高寒、鹽堿地區(qū)的作物特別是糧食作物、經(jīng)濟(jì)植物生長(zhǎng)問題，將來有可能為改造沙漠、綠化荒旱地做出重要貢獻(xiàn)。

5.2 提高海藻糖生產(chǎn)的質(zhì)量和降低成本

在植物抗逆研究中，海藻糖合酶基因是繼谷氨酸、脯氨酸、甜菜堿合成酶基因之后又一個(gè)與抗逆相關(guān)的基因。海藻糖累積于植物體內(nèi)，發(fā)揮保護(hù)功能，從而改良植物的某種不良性狀，達(dá)到優(yōu)化育種效果。為了充分利用海藻糖的抗逆保護(hù)作用和能量?jī)?chǔ)備等生物學(xué)功能，人們主要通過以下兩個(gè)層面對(duì)海藻糖的合成與代謝途徑加以干擾，從而實(shí)現(xiàn)海藻糖在生物體內(nèi)的富集:一種方法是通過對(duì)海藻糖合成酶相關(guān)基因的克隆研究，構(gòu)建其基因表達(dá)載體，并將該載體轉(zhuǎn)入生物體內(nèi)，最終實(shí)現(xiàn)海藻糖的富集。這樣可使果蔬在加工后仍能保留較長(zhǎng)時(shí)間的鮮度，同時(shí)期望開發(fā)出可作為生產(chǎn)海藻糖的植物材料，從而直接以植物體作為天然發(fā)酵罐大量生產(chǎn)海藻糖。另一種方法就是通過抑制海藻糖分解酶，即海藻糖酶的生物活性，阻斷海藻糖的分解途徑，這一目的可以通過化學(xué)手段，也可以通過生物學(xué)手段加以實(shí)現(xiàn)。利用工程微生物和酶工程改進(jìn)海藻糖的生產(chǎn)，也可以提高質(zhì)量，降低成本。近年來海藻糖合成酶基因的克隆和表達(dá)已成為生物學(xué)研究的新熱點(diǎn)，海藻糖酶基因的克隆對(duì)于應(yīng)用基因工程技術(shù)改造菌株，提高細(xì)胞內(nèi)海藻糖的含量至關(guān)重要。

6 海藻糖酶基因的研究

海藻糖合酶基因?qū)χ参锏倪z傳轉(zhuǎn)化開始于Holmstrom等的報(bào)道，目前從許多植物、微生物中已經(jīng)克隆到海藻糖酶基因。由海藻糖合酶基因(trehalase)編碼的海藻糖酶(a.glucoside.glucohydro.1ase)是唯一能夠水解海藻糖的酶，通過水解海藻糖為各種組織器官提供葡萄糖。在果蠅、蝗蟲和家蠶等昆蟲中海藻糖酶有兩種類型，一種為可溶型，另一種為膜固定型，它們是由同一基因表達(dá)而形成的兩種不同產(chǎn)物。

家蠶海藻糖酶基因是一種非組織特異性表達(dá)基因，可以在卵巢、中腸、馬氏管和脂肪體等多種組織中表達(dá)，其表達(dá)受滯育激素(DH)的誘導(dǎo)調(diào)控。家蠶屬于卵滯育型昆蟲，其滯育激素(DH)是由咽下神經(jīng)節(jié)(SG)所分泌的一種神經(jīng)肽，在家蠶的滯育過程中起著關(guān)鍵性作用。卵母細(xì)胞通過位于膜內(nèi)的海藻糖酶，將血液中海藻糖降解成葡萄糖，然后吸收到細(xì)胞內(nèi)，最后合成糖元，從而導(dǎo)致蠶卵的滯育。徐衛(wèi)華等首次以家蠶DHcDNA為探針，用32P2dCTP作標(biāo)記，篩選和克隆了家蠶滯育激素基因，趙巧玲等也對(duì)家蠶海藻糖酶基因5′側(cè)翼區(qū)進(jìn)行了克隆與序列分析，他們?yōu)閺姆肿铀缴辖饷骷倚Q滯育機(jī)理提供了一條新思路，因此，研究海藻糖酶基因是解明家蠶滯育機(jī)理的一條重要途徑。

7 展望

我國(guó)在海藻糖的研究方面起步較晚，但也獲得了很多令人可喜的成果，我國(guó)已成為繼日本之后第2個(gè)能利用淀粉直接生產(chǎn)海藻糖的國(guó)家。隨著海藻糖生產(chǎn)方法的不斷開發(fā)，隨著以淀粉為底物酶法生產(chǎn)海藻糖技術(shù)的成熟，生產(chǎn)成本的不斷降低，海藻糖的各種性質(zhì)正逐漸被人們認(rèn)識(shí)與利用，海藻糖的應(yīng)用領(lǐng)域也越來越廣，而且隨著其對(duì)功能性質(zhì)及作用機(jī)制的深入了解，其應(yīng)用前景必然更加廣泛，作為天然生物保護(hù)劑，它的應(yīng)用可能導(dǎo)致生物產(chǎn)品行業(yè)的重大變革。

在近年來海藻糖的研究倍受關(guān)注，對(duì)海藻糖的生產(chǎn)技術(shù)及其應(yīng)用研究頗為活躍，海藻糖相關(guān)酶的基因工程研究也成為熱點(diǎn)。利用植物生產(chǎn)海藻糖是最有可能得到廉價(jià)產(chǎn)品的方法，國(guó)內(nèi)外科學(xué)家正在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物的研究，因此應(yīng)加強(qiáng)運(yùn)用分子生物學(xué)研究開發(fā)海藻糖制備新工藝；將海藻糖合成酶基因轉(zhuǎn)入植物，在提高植物本身抗逆性的同時(shí)，植物體含海藻糖的量也提高了，這無疑又是一條生產(chǎn)海藻糖的新路。

徐衛(wèi)華和趙巧玲等對(duì)家蠶海藻糖酶基因的分子水平研究，為解明家蠶滯育機(jī)理提供了一條新思路，相信致力于海藻糖酶基因的研究很可能可以解明家蠶滯育機(jī)理，當(dāng)然這需要實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。另外，已經(jīng)有外源海藻糖在黃瓜、小麥上的抗逆性應(yīng)用研究，亦可展開其對(duì)動(dòng)物的作用實(shí)驗(yàn)，探討其對(duì)動(dòng)物尤其是家蠶類的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的抗性作用，這將具有重要意義。

在今后的研究中，應(yīng)深入研究海藻糖的功能特性，進(jìn)一步擴(kuò)大在食品中的應(yīng)用，如對(duì)人體腸道調(diào)節(jié)機(jī)制，作為食品保鮮劑的保鮮機(jī)制和技術(shù)的研究等。結(jié)合紅外光譜和差式掃描量熱法等先進(jìn)的測(cè)試手段，深入研究海藻糖的物理化學(xué)特性，是揭示海藻糖作用機(jī)制的方向。隨著分子生物學(xué)及基因工程的實(shí)驗(yàn)理論與方法的成熟，新技術(shù)的不斷出現(xiàn)及應(yīng)用，對(duì)海藻糖的研究進(jìn)入分子領(lǐng)域，可以預(yù)測(cè)，蛋白質(zhì)與海藻糖的結(jié)合與改性會(huì)成為下個(gè)十年生物化學(xué)與生物制品及動(dòng)植物基因工程的研究熱點(diǎn)。