食藥用菌菌種的液體深層培養(yǎng)

余兆豐

(江蘇鎮(zhèn)江余兆豐生物技術(shù)開發(fā)研究所,鎮(zhèn)江 212001)

1 液體深層發(fā)酵的技術(shù)要點(diǎn)

21世紀(jì)是生物工程的世紀(jì),筆者五十多年來一直與微生物打交道,先后從事病源性微生物——病毒、衣原體、立克次氏體、支原體、細(xì)菌、放線菌、真菌等的研究,期間申報(bào)了10項(xiàng)系列專利,前5項(xiàng)為制種專利,后5項(xiàng)為大生產(chǎn)應(yīng)用專利。

食藥用菌液體菌種必須無菌抽樣作純菌及生長力兩項(xiàng)試驗(yàn),現(xiàn)談幾點(diǎn)食藥用菌深層培養(yǎng)制種及生產(chǎn)應(yīng)用技術(shù)要領(lǐng),以供參考。

1.1 純菌試驗(yàn)

作固、液態(tài)兩種,弱酸性 (pH 6.5～7.0)、弱堿性 (pH 7.2～7.4)兩種試管培養(yǎng)基,抽樣接種后放至24～26℃及35～37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)菌一般在35～37℃條件下培養(yǎng)1～3天判結(jié)果,真菌一般在24～26℃條件下培養(yǎng)3～7天判結(jié)果。將污染的雜菌 (細(xì)菌及霉菌)檢查出來,如無雜菌,只生長目的菌,為合格。

1.2 生長力試驗(yàn)

滅菌后的玻片,在空平皿或空試管中滴一滴菌液,放至適宜溫度下1～2天后鏡檢,生長力強(qiáng)的數(shù)小時(shí)便肉眼可見白色菌絲生長,在顯微鏡下可見到透明度好、著色性強(qiáng)、顆粒不多的菌絲體,能看到鎖狀聯(lián)合的是最佳狀態(tài)。

使用液體菌種需要達(dá)到絕對(duì)的純菌和強(qiáng)生長力。另可測(cè)pH、菌球數(shù)、重量、碳氮比等作為參考。

1.3 深層培養(yǎng)的制種設(shè)備與技術(shù)關(guān)鍵

近幾年,筆者設(shè)計(jì)了夾層控溫或玻璃不銹鋼發(fā)酵罐與滅菌冷卻相結(jié)合的方法,通過技術(shù) (專利)+設(shè)備 (專利)的應(yīng)用,控制污染效果理想。

加溫及保溫均在夾層內(nèi)進(jìn)行 (電熱管置于夾層),滅菌時(shí)夾層加溫是傳導(dǎo)熱,100℃以上產(chǎn)生蒸汽后以軟管或硬管引至內(nèi)層,對(duì)所有管道進(jìn)行對(duì)流蒸汽滅菌,特別是下出液的下口,不留死角。

滅菌后除采用常規(guī)循環(huán)水傳導(dǎo)冷卻外,還將無菌空氣由進(jìn)氣口導(dǎo)入進(jìn)行正壓對(duì)流冷卻,不產(chǎn)生負(fù)壓,以免導(dǎo)致滅菌后污染。

任何微生物生產(chǎn)均要把好消毒滅菌關(guān)、無菌操作關(guān)、培養(yǎng)技術(shù)關(guān),嚴(yán)防雜菌 (細(xì)菌、霉素及本菌外的其他真菌)污染。

筆者80年代設(shè)計(jì)的變壓脈沖滅菌技術(shù),達(dá)到了起磅升溫時(shí)間短,滅菌徹底,不存死角的效果;可以不扎繩、不蓋蓋,易滅菌,易冷卻,易接種。滅菌后冷卻除常規(guī)傳導(dǎo)冷卻外,還通過將過濾空氣壓入滅菌鍋內(nèi),產(chǎn)生對(duì)流冷卻,進(jìn)出端均有過濾裝置,停電時(shí)空氣不會(huì)反流污染。此氣再壓入另一個(gè)密閉的空間內(nèi),進(jìn)出又裝有過濾器,先吹出的是滅菌后的濕空氣,降塵埃;再吹出的是滅菌后的熱空氣,干燥;最后吹出來的是室溫的過濾空氣。讓此密閉空間的氣壓永遠(yuǎn)大于外界的氣壓,形成超凈環(huán)境,培養(yǎng)基出鍋后可直接開放式接種,速度快,效果好,無污染,解決了目前滅菌冷卻難題,適用于流水線大生產(chǎn)。

食藥用真菌深層培養(yǎng)采取管道式密閉接種,無菌操作要達(dá)到百分之百成功,須在第一級(jí)發(fā)酵瓶內(nèi)放1/3玻璃球或玻璃塊,配很薄一層半固體 (液固體也可)培養(yǎng)基滅菌后按一般無菌操作規(guī)程接入菌種。裝入液體培養(yǎng)的管道,一端要接在液體培養(yǎng)基瓶中,一次操作接入所有管道,不再開瓶口。在無污染、目的菌生長良好的情況下,由管道反壓液體培養(yǎng)基至菌種瓶中培養(yǎng),其他按常規(guī)操作,便可達(dá)100%成功。

深層培養(yǎng)的空氣過濾要求濾菌越徹底越好,氣損失越少越好,兩者不能兼得時(shí),則可損失一些氣。筆者采用小氣量滅菌棉花球過濾。棉花有阻擋、截流、靜電吸附、過濾等四種作用,但不能潮濕,任何過濾器及介質(zhì)均不能潮濕。

2 液體菌種深層培養(yǎng)技術(shù)的大生產(chǎn)應(yīng)用

采用筆者的專利 “蒸汽滅菌系統(tǒng)及其滅菌冷卻方法”,在冷卻時(shí)通入經(jīng)過過濾的凈化氣流,出氣端設(shè)置過濾裝置,避免停電時(shí)空氣回流污染;滅菌高壓鍋旁的密閉空間也設(shè)置過濾裝置,使空間氣壓永遠(yuǎn)大于外界氣壓,使之成為級(jí)別相當(dāng)高的GMP車間。在此環(huán)境下,可采用大料滅菌,搞自動(dòng)化、流水線,先接種后裝瓶 (袋),然后裝框床栽。實(shí)施中,若采用真空冷卻,料溫從100℃降到30℃只需10分鐘,其速度之快是現(xiàn)有普通冷卻方法難以比擬的。這項(xiàng)發(fā)明,徹底解決了現(xiàn)有大生產(chǎn)中滅菌、冷卻工藝中的不合理部分。

在大生產(chǎn)中,通過掌握最佳生長時(shí)間,適時(shí)放罐,之后應(yīng)用固態(tài)發(fā)酵配合,解決污染問題。其中特別要掌握好以下5點(diǎn):①營養(yǎng)好一點(diǎn)。因?yàn)樽罴褷顟B(tài)出現(xiàn)在生長期的對(duì)數(shù)期階段,微生物就像孩子處在青春發(fā)育期一樣,需要供給足夠的營養(yǎng),尤其是碳、氮源要有保證。②固體培養(yǎng)基水分少一點(diǎn)。因?yàn)橐后w菌種本身就是液態(tài),生長快,水分太多就會(huì)影響呼吸。③氧氣多一點(diǎn)。注意通風(fēng),供給足夠的氧氣。④酸堿度適中。不要像固體培養(yǎng)基那樣有意將pH調(diào)高以控制污染。因?yàn)楣腆w菌種接下去的是一個(gè)塊,接觸不合適的pH死后變酸的是一個(gè)面,其他面還可生長;而液體菌種就會(huì)不吃料,不生長。⑤在允許溫度范圍內(nèi),溫度要偏高一點(diǎn),否則將由目的菌產(chǎn)生能量抵抗外界溫度才能供其生物能之用。掌握好了上述5點(diǎn),雜菌長不過目的菌,菌絲體產(chǎn)品只需2～3天就能完成。

3 十項(xiàng)專利項(xiàng)目題錄

(1)一種食用菌液體培養(yǎng)方法(ZL:86102421.4);

(2)袋栽食用菌液體菌種多管接種器 (ZL:87209482.0);

(3)液體菌種深層培養(yǎng)簡(jiǎn)易裝置(ZL:87210089.8);

(4)無菌空氣輸出控制器 (ZL:88206277.8);

(5)微生物制品生產(chǎn)用簡(jiǎn)易發(fā)酵裝置 (ZL:98227774.1);

(6)雙態(tài)微生物液體掊養(yǎng)菌絲體的兩次發(fā)酵法(200510007461.2);

(7)螺旋式發(fā)酵罐 (ZL:200520004916.0);

(8)食用菌培養(yǎng)基滾筒式滅菌器(ZL:200520004915.6);

(9)一種液體菌種直接生產(chǎn)木腐菌類的方法(ZL:200510007460.8);

(10)蒸汽滅菌系統(tǒng)及其滅菌冷卻方法 (ZL:200810024591.0)。