乙酰膽堿酯酶法在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用及質(zhì)量控制

李衛(wèi)霞

（重慶三峽學(xué)院生物系，重慶 萬(wàn)州 404000）

隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的迅速發(fā)展，環(huán)境污染問(wèn)題日益顯著，人們對(duì)于食品安全問(wèn)題也日益關(guān)注。我國(guó)是農(nóng)藥使用的大國(guó)，農(nóng)藥殘留的現(xiàn)象普遍存在，然而現(xiàn)有的一些檢測(cè)方法已無(wú)法滿足高靈敏度的要求，因此建立一種快速靈敏的農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法具有十分重要的意義。酶法操作簡(jiǎn)單，速度快，不需要昂貴儀器，適應(yīng)于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)和對(duì)大規(guī)模食品的篩選檢測(cè)，被廣泛用于野外農(nóng)藥殘留快速檢驗(yàn)?？捎糜谵r(nóng)藥殘留檢測(cè)的酶有羧酸酯酶、丁酰膽堿酯酶及乙酰膽堿酯酶，前兩種酶受干擾因素多，假陽(yáng)性率高，專一性低[1-2]。乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）由于具有較好敏感性及較高的活性，在有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥檢測(cè)中應(yīng)用廣泛。

1 乙酰膽堿酯酶法原理

乙酰膽堿酯酶是生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的一種關(guān)鍵性酶，能夠高效水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿，保證神經(jīng)沖動(dòng)在突觸間的正常傳導(dǎo)，它的活性受到有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的特異性抑制，故而成為監(jiān)控有機(jī)磷農(nóng)藥的靶酶[3]。乙酰膽堿酯酶催化的反應(yīng)如下：

HO（CH3）3NCH2CH2OOCCH3（乙酰膽堿）+H2O→HO（CH3）3NCH2CH2OH（膽堿）+CH3COOH

利用這一特性，用濾紙片或電極作為載體，將乙酰膽堿酯酶吸附在上面，加入顯色劑，如果酶的活性沒(méi)有被抑制，則生成的產(chǎn)物可以使顯色劑顯色，如果被測(cè)樣品中含有農(nóng)藥殘留則酶活性被抑制不能生成水解產(chǎn)物，顯色劑不顯色。根據(jù)顏色的變化或測(cè)定酶與某種特定化合物反應(yīng)的物理化學(xué)信號(hào)的變化，可判斷是否存在有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥[4]。

2 乙酰膽堿酯酶法分類

酶抑制法依據(jù)其特異性抑制昆蟲中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中乙酰膽堿酯酶的活性，破壞神經(jīng)的正常傳導(dǎo)，使昆蟲中毒致死的毒理學(xué)原理，將乙酰膽堿酯酶與樣品反應(yīng)，根據(jù)乙酰膽堿酯酶活性受抑制程度，檢測(cè)樣品中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥含量。乙酰膽堿酯酶對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥較敏感，測(cè)定的靈敏度高，選擇性強(qiáng)。在實(shí)際應(yīng)用中主要包括速測(cè)卡、速測(cè)儀、生物傳感器三種類型。

2.1 速測(cè)卡

速測(cè)卡即酶抑制試紙法，將從敏感生物體內(nèi)提取的乙酰膽堿酯酶和乙酞膽堿類似物2，6-二氧靛酚乙酸醋分別固定到濾紙上。如果樣品中不含有有機(jī)磷或氨基甲酸醋類農(nóng)藥，則靛酚乙酸醋在酶的催化下生成藍(lán)色靛酚。當(dāng)樣品中含有有機(jī)磷或氨基甲酸醋類農(nóng)藥，乙酞膽堿醋酶則與其結(jié)合，失去了催化靛酚乙酸醋的能力。該方法簡(jiǎn)單實(shí)用，即通過(guò)肉眼觀察卡片的顏色確定農(nóng)殘是否超標(biāo)。這種方法的檢出限為 0.3～10.0 mg/kg[5]。

2.2 速測(cè)儀

速測(cè)儀即酶抑制分光光度法，是將分光光度計(jì)進(jìn)行改裝和簡(jiǎn)化，配上檢測(cè)試劑（多是將底物、酶、顯色劑制成三種不同顏色的藥片），測(cè)定方法與常規(guī)酶活力測(cè)定方法相同，以酶活性抑制率為指標(biāo)判定是否農(nóng)殘超標(biāo)。該方法具有較高的可靠性和靈敏性，且操作簡(jiǎn)單，測(cè)定速度快，是目前常用的方法，很適合于水中和市售新鮮蔬菜的農(nóng)殘快速檢測(cè)，檢測(cè)限在 0.029～10.0 mg/L[6]。

2.3 生物傳感器

生物傳感器是根據(jù)生物敏感部件與特定分析物之間的反應(yīng)產(chǎn)生的一些物理化學(xué)信號(hào)的變化，將其轉(zhuǎn)化后記錄下來(lái)。檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度有了很大的改善，自動(dòng)化程度和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)能力等方面有了較高的提高，檢測(cè)限可達(dá)20 ppb[6]。包括電流型生物傳感器和電位型生物傳感器，前者的工作原理：底物氯化乙酞硫代膽堿在膽堿醋酶的催化作用下可以水解為乙酸和琉基膽堿，當(dāng)膽堿醋酶被農(nóng)藥抑制時(shí)，氧化電流的大小能準(zhǔn)確地反應(yīng)酶被抑制的程度，從而檢測(cè)出農(nóng)藥殘留的濃度[7]。而電位型傳感器則中電位性傳感器是將酶反應(yīng)產(chǎn)生的pH值變化由傳感器測(cè)出，從而間接測(cè)定有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量[6]。

3 乙酰膽堿酯酶法在農(nóng)殘檢測(cè)中的應(yīng)用

由于有機(jī)磷、氨基甲酸酯類農(nóng)藥使用不當(dāng)或誤食這兩類農(nóng)藥殘留量超標(biāo)的蔬菜而引起的中毒現(xiàn)象一直十分嚴(yán)重。使用酶抑制法檢測(cè)農(nóng)藥殘留量從20世紀(jì)50年代開(kāi)始陸續(xù)有報(bào)道。酶抑制分析法與其它分析方法相比，最大的特點(diǎn)就是它的特異性，分析速度也比較快。

利用酶抑制法比色原理生產(chǎn)的各種速測(cè)卡、速測(cè)儀正逐步進(jìn)入果蔬生產(chǎn)基地、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、超市及監(jiān)督部門，成為我國(guó)農(nóng)藥殘留快速測(cè)定的主流技術(shù)。趙建莊[8]用自行研制的便攜式農(nóng)藥殘留速測(cè)儀，對(duì)果蔬中農(nóng)藥殘留毒性進(jìn)行快速檢測(cè)，可以直接顯示有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制率，確定農(nóng)藥殘留毒性水平。2007年李昕等應(yīng)用家蠅頭部提出的乙酰膽堿酯酶檢測(cè)果蔬上10種有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥，檢測(cè)靈敏度0.001～0.1 mg/kg范圍。與目前國(guó)內(nèi)外使用的同類檢測(cè)方法相比，如各種速測(cè)儀、酶紙片法檢測(cè)靈敏度一般在0.1～10.0 mg/kg范圍，檢測(cè)靈敏度有顯著提高[9]。

乙酰膽堿酯酶法除用于食品及果蔬中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)，還可用于檢測(cè)水體污染狀況。宋燕華等[10]用乙酰膽堿酯酶為生物標(biāo)志物進(jìn)行錢塘江水環(huán)境野生鯽魚有機(jī)磷農(nóng)藥暴露的研究發(fā)現(xiàn)，部分地區(qū)野生鯽魚血乙酰膽堿酯酶活性受到抑制，說(shuō)明水環(huán)境中水環(huán)境中存在機(jī)磷農(nóng)藥的污染。此外，中藥材中有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留的測(cè)定方法主要有氣相色譜法，氣相色譜-質(zhì)譜法等，這些檢測(cè)方法需對(duì)樣品進(jìn)行分離、提取、衍生化等預(yù)處理，耗時(shí)，且不適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。2009年陳安珍等[11]用膽堿酯酶法對(duì)中藥材中的有機(jī)磷和氨基甲酸酯進(jìn)行檢測(cè)，最低檢出濃度為0.1 μg/mL。

生物傳感器是目前農(nóng)藥殘留分析技術(shù)的研究熱點(diǎn)。2003年魏福祥[12]將活化好的硝酸纖維素膜浸入到乙酰膽堿酯酶、戊二醛、牛血清白蛋白的混合液中，采用共價(jià)交聯(lián)法制備出酶片，制備出安培型生物傳感器。2008年柳娜等[13]研究發(fā)現(xiàn)硫代黃素T與乙酰膽堿酯酶形成超分子復(fù)合物，產(chǎn)生了特征熒光峰。而有機(jī)磷農(nóng)藥可破壞此復(fù)合物使硫代黃素T的特征熒光峰被猝滅，猝滅強(qiáng)度與對(duì)氧磷濃度存在線性關(guān)系。若利用此原理制備出檢測(cè)AChE抑制劑的熒光光纖生物傳感器，擁有檢測(cè)迅速、靈敏度高、線性范圍較寬、不需要消耗酶底物和抗干擾能力強(qiáng)等特點(diǎn)，具有較好的應(yīng)用前景。

4 質(zhì)量控制因素

影響酶抑制法檢測(cè)效果的因素很多，與酶源、有機(jī)磷農(nóng)藥類型檢測(cè)系統(tǒng)等均有關(guān)系，從而造成檢出限相差較大。源自不同物種或取自一個(gè)生物體的不同組織的一種酶，其活性測(cè)定的最適條件經(jīng)常會(huì)變化，影響條件通常包括最適 pH值、酶促反應(yīng)時(shí)間及溫度及抑制劑等方面[14]。

4.1 酶源

酶抑制法常用的酶源有：植物酶、牛、豬等家畜的肝臟酯酶、人血漿或血清、馬血清、蠅或蜜蜂頭部的腦酯酶、兔或鼠的羧酸酯酶等[15]。但不同種類、不同來(lái)源的酶源對(duì)檢測(cè)靈敏度具有較大的影響。1996年余孝穎等[16]研究發(fā)現(xiàn)，家蠅頭部乙酰膽堿酯酶對(duì)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的敏感度要優(yōu)于其他來(lái)源的膽堿酯酶。從昆蟲組織中提取的乙酰膽堿酯酶粗酶液中除了含乙酰膽堿酯酶外，還有其他多種酶類的存在，會(huì)顯著影響到酶的特性，其中一些酶是解毒酶，能夠催化水解農(nóng)藥，也有些酯酶能夠作為乙酰膽堿酯酶的替代靶標(biāo)，起到保護(hù)乙酰膽堿酯酶的作用。實(shí)驗(yàn)中如果用分離純化后的酶液作為乙酰膽堿酯酶源來(lái)測(cè)定酶的動(dòng)力學(xué)特性和抗抑制性，則能避免這些問(wèn)題[17]。

此外在淡水魚及海洋魚類中也可以提取膽堿酯酶，淡水魚中首魚科中的大黃魚、小黃魚、黃姑魚、白姑魚肌肉中的膽堿酯酶對(duì)有機(jī)磷化合物相當(dāng)靈敏，除小黃魚酶液比活較低外，其余3種魚的酶溶液比活基本相同[9]。2008年邱朝坤等[18]研究發(fā)現(xiàn)鯽魚不同組織中乙酰膽堿酯酶活性存在很大差異，魚腦酶活為35.242 μmol/min·g，肝臟酶活為4.826 μmol/min·g，肌肉酶活為 26.018 μmol/min·g。

4.2 酶的固定化

乙酰膽堿酯酶的固定化技術(shù)在酶抑制顯色法、檢測(cè)農(nóng)藥殘留及生物傳感技術(shù)的開(kāi)發(fā)中受到廣泛的關(guān)注[19]。目前應(yīng)用較為廣泛的固定化技術(shù)主要有吸附法、交聯(lián)法、電聚合法等[20-21]。2007年王燁等[22]研究發(fā)現(xiàn)，以殼聚糖為載體，吸附-交聯(lián)法制備乙酰膽堿酯酶膜，經(jīng)檢測(cè)固定化酶Km較游離酶的Km降低，最適pH值升高。乙酰膽堿酯酶在固定化后穩(wěn)定性得到了較大的提高，這是由于固定化增加了酶構(gòu)象的牢固程度、擋住了不利因素對(duì)酶的侵襲或限制了酶分子間的相互作用，使得酶的穩(wěn)定性有了顯著的提高，酶膜的實(shí)際應(yīng)用性能較游離酶有了較大的改善。

4.3 酶促反應(yīng)溫度、時(shí)間、pH值

酶促反應(yīng)過(guò)程中保溫時(shí)間、溫度、pH對(duì)酶活都有極其顯著影響，邱朝坤等[18]通過(guò)對(duì)鯽魚乙酰膽堿酯酶研究發(fā)現(xiàn)保溫溫度、保溫時(shí)間和pH值三個(gè)因素對(duì)酶活影響都達(dá)到了極其顯著的水平，三個(gè)因素對(duì)酶活的影響次序依次為：時(shí)間＞pH值＞溫度。魚腦酶活測(cè)定的最佳條件為保溫時(shí)間35 min，保溫溫度32℃，pH 7.6。肝臟酶活測(cè)定的最佳條件為保溫時(shí)間28 min，保溫溫度 30℃，pH 7.6。肌肉酶活測(cè)定的最佳條件為保溫時(shí)間 31 min，保溫溫度31℃，pH 7.6。2008年彭霞等[17]研究發(fā)現(xiàn)，家蠶頭部乙酰膽堿酯酶在pH 7.2～8.0范圍內(nèi)保持較高的酶活力，最適pH為7.5，最適反應(yīng)溫度為37℃。酶的活性直接影響到用酶抑制法檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的可靠性和靈敏度。因而研究酶活測(cè)定時(shí)的影響因素（包括最適pH值、酶促反應(yīng)時(shí)間及溫度）從而保證酶活穩(wěn)定性及靈敏度就尤為重要。

4.4 抑制劑

生態(tài)毒理學(xué)的研究表明，有機(jī)磷農(nóng)藥的濃度與乙酰膽堿酯酶活性的受抑制程度之間存在著良好的線性關(guān)系[23]，因而酶的活性直接影響到用酶抑制法檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的可靠性和靈敏度。

有機(jī)磷、氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)乙酰膽堿酯酶有強(qiáng)烈的抑制作用，主要是它們能夠與乙酰膽堿酯酶的活性部位快速不可逆地結(jié)合，使酶失活，從而引起中毒，起到殺蟲的作用[17]。

大多數(shù)有機(jī)磷農(nóng)藥的純品對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制能力很弱，它們必須在生理?xiàng)l件下激活才具有強(qiáng)的抑制能力。有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制具有選擇性，主要是酶分子和抑制劑分子結(jié)構(gòu)的影響。大多數(shù)乙酰膽堿酯酶抑制劑6～10 mol/L抑制5～50 min，就能抑制酶的大部分活性[22]。影響抑制效果的化學(xué)因素包括有機(jī)磷農(nóng)藥上取代基的親電性質(zhì)、大基團(tuán)效應(yīng)、膽堿式結(jié)構(gòu)、不對(duì)稱效應(yīng)。取代基不同而導(dǎo)致的抑制能力的改變，其比較只能在同系物間進(jìn)行[22]。

5 發(fā)展前景

利用有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥特異性抑制乙酰膽堿酯酶活性的毒理學(xué)原理，研制農(nóng)產(chǎn)品、食品農(nóng)藥殘留速測(cè)卡，檢測(cè)目標(biāo)強(qiáng)，靈敏度較高，儀器簡(jiǎn)單，時(shí)間短，前處理容易，尤其適于農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)基地、配送中心和蔬菜批發(fā)等部門現(xiàn)場(chǎng)速測(cè)，是目前實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)最為穩(wěn)定可行的技術(shù)選擇[24-25]，目前根據(jù)此方法原理所生產(chǎn)的多種規(guī)格果蔬農(nóng)藥殘留速測(cè)儀已取得一定的應(yīng)用效果。

此方法可對(duì)含農(nóng)藥殘毒的蔬菜進(jìn)行粗篩，將一部分含農(nóng)藥殘毒的蔬菜控制在市場(chǎng)外，避免農(nóng)藥中毒事故發(fā)生，讓人們吃上相對(duì)放心的蔬菜，是一種野外條件下食品檢驗(yàn)的理想方法。但是此方法只能檢測(cè)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥，不適用于其他農(nóng)藥殘毒的檢測(cè)。生物傳感器在測(cè)定方法多樣化、提高測(cè)量靈敏度、縮短反應(yīng)時(shí)間、提高儀器自動(dòng)化程度和適應(yīng)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)能力等方面都有很大進(jìn)步。但也存在一些問(wèn)題：分析結(jié)果的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和使用壽命等方面。隨著新技術(shù)、新材料的不斷涌現(xiàn)，生物傳感器將向更加小型化、適用化方向發(fā)展。

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