有機(jī)溶劑體系中癸酸甘油酯的酶法合成

李 論

(江蘇省淮安質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局,江蘇淮安 223001)

有機(jī)溶劑體系中癸酸甘油酯的酶法合成

李 論

(江蘇省淮安質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局,江蘇淮安 223001)

從最常用的有機(jī)溶劑體系著手,進(jìn)行了有機(jī)溶劑體系中脂肪酶催化辛酸與甘油酯化制備功能性中鏈甘油酯的研究,探討酶量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、底物比率等對(duì)反應(yīng)的影響。

有機(jī)溶劑;癸酸甘油酯;酶法合成

目前,用于酶促反應(yīng)的非水介質(zhì)主要包括:①與水混溶的有機(jī)溶劑和水形成的均一體系;②水與有機(jī)溶劑形成的兩相或多相體系;③含微量水的有機(jī)溶劑;④超臨界流體;⑤反相膠束;⑥無(wú)溶劑體系;⑦離子液[1]。超臨界流體和離子液是兩種綠色反應(yīng)介質(zhì),其在脂肪酶催化反應(yīng)方面的應(yīng)用也有報(bào)道[2-3];但其作為一種反應(yīng)介質(zhì)在油脂改良方面的研究報(bào)道卻非常少。目前在甘油酯的合成中,應(yīng)用最多的是含微量水的有機(jī)溶劑體系和無(wú)溶劑體系。

1 材料和方法

1.1 材料

固定化脂肪酶(Lipozyme,來(lái)自Candida rugosa)、癸酸、癸酸甘油單酯,癸酸甘油二酯和癸酸甘油三酯均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司(Steinhe im,Germany)。甘油和其他試劑為分析純或色譜純。

1.2 酯化反應(yīng)

將3.0mmol癸酸、1.0mmol甘油加入到裝有3mL正己烷的10 mL帶螺旋蓋的玻璃試管中,旋緊蓋子,在反應(yīng)溫度下預(yù)熱使反應(yīng)物溶解并混合均勻,然后加入50.0 mg固定化脂肪酶。反應(yīng)混合物在40℃旋轉(zhuǎn)水浴鍋中以150 r/min的轉(zhuǎn)速反應(yīng)24 h。加入3.5 mL乙醇/丙酮(1∶1,體積比)終止該反應(yīng)。采用乙酸銅法測(cè)定反應(yīng)混合物中剩余的游離脂肪酸量。每次測(cè)定的百分比轉(zhuǎn)化率表示為消耗癸酸物質(zhì)的量占起始癸酸物質(zhì)的量的百分比。

1.3 產(chǎn)品組成的鑒定

酯化反應(yīng)在最佳的反應(yīng)條件下進(jìn)行。最佳反應(yīng)條件為:溫度,40℃;時(shí)間24h;底物物質(zhì)的量比2.5;脂肪酶100.0 mg。反應(yīng)結(jié)束后,反應(yīng)混合物通過(guò)無(wú)水硫酸鈉柱子除掉水分和脂肪酶。用薄層層析法對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行分離(GF254硅膠板,厚度1 mm,20 cm×20 cm),展開(kāi)劑為氯仿∶丙酮(9.5∶0.5,體積比)。

1.4 產(chǎn)物的液相色譜(HPLC)分析

丙酮作為溶解樣品的溶劑,取10μL樣品進(jìn)行HPLC分析。HPLC系統(tǒng)為美國(guó)Agilent公司儀器,配有R I檢測(cè)器和ODS-C18色譜柱(5μm,4.6 mm×250 mm,Agilent),以乙腈∶乙酸(94∶6,體積比)作為洗脫溶劑,采用梯度洗脫。梯度程序?yàn)?起始洗脫劑流速1 mL/min,保持7 min,然后在1 min內(nèi)線性增加到2 mL/min,保持8 min,最后在1 min內(nèi)線性降到1 mL/min,保持3 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 時(shí)間對(duì)酯化反應(yīng)的影響

在酶催化反應(yīng)中,要以最低的生產(chǎn)費(fèi)用獲得最高產(chǎn)物量,反應(yīng)時(shí)間是確定最佳反應(yīng)條件中必需研究的一個(gè)關(guān)鍵因素。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),轉(zhuǎn)化率增加。尤其在0～16 h之間,酯化初始速率增加很快,超過(guò)16 h后,轉(zhuǎn)化率的增長(zhǎng)速度較慢。

2.2 有機(jī)溶劑對(duì)酯化反應(yīng)的影響

當(dāng)酶懸浮于有機(jī)溶劑中時(shí),酶構(gòu)象的改變導(dǎo)致其底物專一性、立體選擇性的改變和穩(wěn)定性的提高。有機(jī)溶劑的極性對(duì)于酶的催化活性至關(guān)重要,因?yàn)樗绊懼副韺咏Y(jié)合水的多少。在癸酸與甘油的酯化反應(yīng)中,為了選擇出一種適宜的有機(jī)溶劑作為反應(yīng)介質(zhì),對(duì)不同的lgP值的有機(jī)溶劑:丙酮(lgP=-0.23)、乙酸乙酯(lgP=0.68)、氯仿(lgP=2.0)、正己烷(lgP=3.5)、正庚烷(lgP=4.00)、異辛烷(lgP=4.2)、正辛烷(lgP=4.5)、正癸烷(lgP=5.60)進(jìn)行了研究。脂肪酶在正己烷、異辛烷、正辛烷和正庚烷等非極性有機(jī)溶劑中比極性有機(jī)溶劑表現(xiàn)更活躍。lgP(給定溶劑在水和正辛醇中的分配系數(shù))>2.00的非極性有機(jī)溶劑被證明是最合適的溶劑。本研究結(jié)果表明,正己烷和異辛烷是Lipozyme催化癸酸與甘油酯化反應(yīng)的最佳溶劑。

2.3 底物物質(zhì)的量比對(duì)酯化反應(yīng)的影響

在酶催化的反應(yīng)中,底物比率對(duì)酶的催化活性有很大的影響。在本研究中,保持癸酸的量不變(3 mmol),同時(shí)改變辛酸的量(0～30 mmol),希望能以最佳的底物比率獲得最大轉(zhuǎn)化率。從理論上講,高的底物比率應(yīng)該使反應(yīng)向產(chǎn)物方向移動(dòng),癸酸轉(zhuǎn)化率也相應(yīng)提高,但事實(shí)并非如此。最佳的癸酸甘油物質(zhì)的量比為2.5,超過(guò)此比例,轉(zhuǎn)化率沒(méi)有提高,反而下降。反應(yīng)混合物中的甘油過(guò)剩抑制了酶的活性。過(guò)量甘油導(dǎo)致大量的酶溶解在甘油中,從而降低了界面脂肪酶濃度,可能降低反應(yīng)速率。

2.4 酶量對(duì)酯化反應(yīng)的影響

在酶催化反應(yīng)中,酶量也是一個(gè)關(guān)鍵的因子。它決定著反應(yīng)進(jìn)程的快慢。在一定條件下加大酶量,可以加快反應(yīng)速度,提高產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率。隨著脂肪酶量增加,MCG的合成量也增加。當(dāng)脂肪酶超過(guò)100.0 mg時(shí),MCG的產(chǎn)量沒(méi)有顯著增長(zhǎng)。酶量的不斷增大可以提高酯化反應(yīng)的進(jìn)程,但逆反應(yīng)進(jìn)程同時(shí)也加快。另外,過(guò)高的酶量還會(huì)帶入體系過(guò)多的水分,而且酯化反應(yīng)本身就會(huì)形成一定量的水,因此隨酶量增加,水解副反應(yīng)發(fā)生的進(jìn)程也會(huì)加快。故過(guò)高酶量并不一定有利于產(chǎn)物產(chǎn)量的提高。

2.5 初始水活度(aw)對(duì)酯化反應(yīng)的影響

酶需要少量的水維持其活性的三維構(gòu)象狀態(tài),即使是共價(jià)鍵鍵合到一個(gè)支持物上的酶也不例外。水影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性、活性位點(diǎn)的極性和穩(wěn)定性。酶周圍水的存在,能降低酶分子的極性氨基酸的相互作用,防止產(chǎn)生不正當(dāng)?shù)臉?gòu)象結(jié)構(gòu)?？刂扑只疃葘?duì)于脂肪酶發(fā)揮催化活性非常重要。在一定范圍內(nèi),隨著水分增加酶活性也逐漸提高,但水分過(guò)多又會(huì)導(dǎo)致酶活性的降低和甘油三酯的水解。因此對(duì)于一個(gè)特定的反應(yīng),必須確定其最適水量。

2.6 溫度對(duì)酯化反應(yīng)的影響

反應(yīng)溫度是酶促反應(yīng)中的一個(gè)重要的因子。反應(yīng)溫度對(duì)癸酸/甘油酯化反應(yīng)的影響:在10～60℃之間,癸酸轉(zhuǎn)化率變化比較大,溫度比較低時(shí),隨溫度升高其轉(zhuǎn)化率也提高,50℃時(shí)其轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高,但40～50℃之間沒(méi)有明顯的變化,當(dāng)反應(yīng)溫度超過(guò)50℃時(shí),癸酸轉(zhuǎn)化率急劇降低。對(duì)于吸熱反應(yīng)而言,高溫使熱力學(xué)平衡向產(chǎn)物方向移動(dòng),有利于產(chǎn)物產(chǎn)量的提高。本研究中,反應(yīng)在有機(jī)溶劑體系中進(jìn)行,不存在底物溶解性問(wèn)題,反應(yīng)體系的黏度問(wèn)題也不存在。因此可以避免使用過(guò)高的反應(yīng)溫度。

2.7 產(chǎn)品組成分析

分析產(chǎn)品混合物的典型液相色譜發(fā)現(xiàn),剩余游離癸酸物質(zhì)的量比為18.31%,有81.69%的癸酸轉(zhuǎn)化為MCG。在產(chǎn)品中癸酸甘油單酯、癸酸甘油二酯和癸酸甘油三酯的百分比分別為8.60%、35.18%和56.22%。結(jié)果表明,來(lái)源于C.rugosa的脂肪酶可被用于生產(chǎn)癸酸甘油二酯和癸酸甘油三酯。

3 結(jié)論

本文以來(lái)源于Candida rugosa的脂肪酶作為催化劑,進(jìn)行了有機(jī)溶劑中酶促癸酸和甘油酯化合成中鏈甘油酯的研究?？疾炝嗣噶俊⒌孜锉嚷?、反應(yīng)時(shí)間、有機(jī)溶劑和水分活度對(duì)反應(yīng)的影響。結(jié)果表明最佳反應(yīng)條件為:溫度,40℃;時(shí)間,24 h;底物物質(zhì)的量比2.5;酶量100 mg。反應(yīng)中所用的有機(jī)溶劑對(duì)酶的催化活性有極大的影響,一般而言,在logP為3.5～4.0的非極性有機(jī)溶劑中,脂肪酶的催化活性比較高。在起始水分活度aw為0.33時(shí),可以獲得最大產(chǎn)物產(chǎn)率。對(duì)最終反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析表明,來(lái)源于Candida rugosa的脂肪酶有利于癸酸甘油二酯和癸酸甘油三酯的催化合成,而癸酸甘油單酯的合成催化能力比較差。

[1］Krishna S H.Developments and trends in enzyme catalysis in nonconventional media[J].Biotechnology Advances,2002,20:239-267

[2］Oliviera J V,Oliviera D.Kinetics of the enzymatic alcoholysis of palm kernel oil in supercritical CO2[J].Int Eng Chem Res,2000,39(12):4450.

[3］MillerD A,Blanch H W,Prausnitz J M.Enzymatic interesterification of triglycerides in supercritical carbondioxide[J].AnalN YAcad Sci,1990,613:534.

TQ225.242

A

1003-3467(2010)18-0030-02

2010-07-21

李 論(1973-),男,工程師,主要從事技術(shù)管理工作,電話:13705238812。