微生物技術(shù)在葡萄酒酵母選育中的應用

王顯蘇，孫玉霞

（山東省釀酒葡萄科學研究所，山東 濟南 250100）

微生物技術(shù)在葡萄酒酵母選育中的應用

王顯蘇，孫玉霞

（山東省釀酒葡萄科學研究所，山東 濟南 250100）

本文綜述了微生物技術(shù)在葡萄酒酵母選育中的應用，主要包括天然酵母的篩選、定向馴化；誘變、雜交、原生質(zhì)體融合技術(shù)選育具有某種特性的葡萄酒酵母；并對基因技術(shù)對葡萄酒酵母的改良做了一定的介紹.

微生物技術(shù)；葡萄酒酵母；選育

根據(jù)國際葡萄與葡萄酒組織(OIV，1996)的規(guī)定，葡萄酒只能是破碎或未破碎的新鮮葡萄果實或葡萄汁經(jīng)完全或部分酒精發(fā)酵后獲得的飲料.在這一過程中起主導作用的微生物是釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），它對葡萄酒發(fā)酵具有根本性影響，它的性能不僅直接影響葡萄酒的產(chǎn)量、質(zhì)量和經(jīng)濟性，還對葡萄酒特色與風格的形成至關(guān)重要.

葡萄汁的發(fā)酵可以是自然發(fā)酵，也可以是純種發(fā)酵.自然發(fā)酵是由葡萄上或釀酒廠中自然存在的微生物進行的發(fā)酵.產(chǎn)膜的假絲酵母(Candida)、葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniaspora)及釀酒酵母在自然發(fā)酵初期占據(jù)主導地位，主要來自葡萄漿果表面；發(fā)酵中期主要為畢赤氏酵母(Pichia)；后期則全部為酵母屬的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）[1].采用自然發(fā)酵時，發(fā)酵過程仍然會比較緩慢，產(chǎn)品質(zhì)量也不穩(wěn)定，另一方面早期雜酵母的生長所產(chǎn)生的次生代謝物質(zhì)積累，可能對葡萄酒品質(zhì)產(chǎn)生影響.

現(xiàn)代化的葡萄酒生產(chǎn)要求產(chǎn)品質(zhì)量保持穩(wěn)定，葡萄酒需要具有一貫的口感風味.為了獲得迅速可靠的發(fā)酵，通常采用各種精選的商業(yè)酵母菌株.它們可以快速有效地催化將葡萄中的糖轉(zhuǎn)化為酒精的過程，同時不產(chǎn)生任何不良氣味.隨著消費者對葡萄酒品質(zhì)要求的不斷提高、口味的多樣化和更高的環(huán)保標準，釀酒師期望獲得具有各種特定性能的酵母菌株，從而提高葡萄酒的市場競爭力和商業(yè)價值，因此應用微生物技術(shù)對葡萄酒酵母菌株進行選育和基因改良工作已逐漸成為這一領(lǐng)域的研究熱點.

1 葡萄酒酵母的篩選

受地域、氣候和土壤等因素的影響，各產(chǎn)區(qū)的葡萄品質(zhì)不盡相同，因而選用從當?shù)仄咸褕@或釀酒廠分離、篩選出的優(yōu)良天然酵母進行發(fā)酵，釀制具有地域特色或獨特風格的葡萄酒在產(chǎn)品日益同質(zhì)化的今天，是提高市場競爭力的有力措施.徐艷文[2]以莫高葡萄酒廠和祁連葡萄酒廠的葡萄生產(chǎn)基地的葡萄漿果表面、土壤、設備表面等為分離源分離葡萄酒相關(guān)酵母菌；王慧等[3]從山東、甘肅、寧夏、陜西、新疆釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)采集的99份葡萄果粒中分離到酵母258株，通過抗性和發(fā)酵特性評價，篩選出3株發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株.可供篩選的葡萄酒酵母來源廣泛，主要來自葡萄果皮表面、葡萄園園區(qū)土壤、發(fā)酵醪、發(fā)酵車間、酒窖及自然變異的生產(chǎn)菌株等.根據(jù)不同的要求，對于已獲取的優(yōu)良葡萄酒酵母，必須經(jīng)過多菌株的發(fā)酵比較，根據(jù)其發(fā)酵能力和發(fā)酵結(jié)果篩選出適合某種葡萄酒生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)酵母.

2 葡萄酒酵母的馴化

從自然界篩選的野生酵母，一般很難直接用于發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)，需要進一步的馴化培養(yǎng)，才能使其達到工業(yè)大生產(chǎn)的要求.進行菌種馴化時，根據(jù)所要達到的目標，設置特定的培養(yǎng)條件，反復培養(yǎng)分離，直至達到預定的目標.工業(yè)上的菌種馴化工作主要是從克服環(huán)境的影響方面來進行的，如溫度、pH、酸度、糖度等各種脅迫環(huán)境，使之適應工業(yè)發(fā)酵要求，提高產(chǎn)酒率，促進發(fā)酵過程的順暢，減少不必要的產(chǎn)物.宋安東等[4]對酵母Y02進行了耐高糖、耐酒精等性能的馴化實驗，經(jīng)馴化后的菌株可以耐受35%的糖度和25%的酒精度.

3 誘變育種

通過用物理因素或化學因素獲得誘變菌株是較簡單的直接改良酵母菌株的方法，應用廣泛的物理手段有紫外線、X射線、γ-射線等，化學手段有硫酸二乙酯(DFS)、5- 溴尿嘧啶(5-BU)、氮芥(Nm)、亞硝基胍(NTG)等.尹吉泰等[5]使用EMS對出發(fā)菌株CⅠ進行誘變，通過蛋氨酸抗性平板，篩選出了一株產(chǎn)硫化氫低、產(chǎn)谷胱甘肽高的葡萄酒酵母.

4 雜交育種

雜交育種是利用酵母的生活史、不同遺傳特性和相反交配型的細胞產(chǎn)生的雙倍體等特點，可以消除菌株在經(jīng)歷長期誘變后所出現(xiàn)的產(chǎn)量性狀難以繼續(xù)提高的障礙，因此是一種重要的育種手段.如對白葡萄酒酵母R2進行紫外線誘變的方法進行定向選育和馴化，篩選出耐低溫菌株，再與耐酒精酵母進行有性雜交，篩選出在保持原有發(fā)酵性能的條件下具備耐低溫耐酒精的特性的菌株[6].

5 原生質(zhì)體融合

原生質(zhì)體融合技術(shù)又稱細胞融合技術(shù)，是指兩種不同的菌株經(jīng)酶法去壁后，得到的原生質(zhì)體(球)，置于高滲溶液中，在一定融合劑的促融作用下使兩者相互凝集并發(fā)生細胞之間的融合，進而導致基因重組，獲得融合了親本優(yōu)良性能的新菌株的育種方法.如李華等[7]對葡萄酒酵母 1450(Chxs、Ampr)和酒球菌SD22a(Chxr、Amps)的原生質(zhì)體制備方法進行了研究,并采用PEG和Ca2+促融的方法進行了兩菌株的跨界原生質(zhì)體融合，篩選出1株在酒精發(fā)酵的同時降解蘋果酸能力強的融合子.與其他育種技術(shù)相比，其具有雜交頻率較高、受接合型或致育型的限制較小和遺傳物質(zhì)更為完整，并且存在著兩株以上親株同時參與融合形成融合子的可能性等優(yōu)點，提高菌株產(chǎn)量和品質(zhì)的潛力較大.

6 基因工程技術(shù)

此項技術(shù)是利用基因工程手段，從生物體內(nèi)提取出所要表達的基因或人工合成的DNA片段，導入適當?shù)妮d體，再轉(zhuǎn)入釀酒酵母細胞中，使遺傳物質(zhì)重新組合，從而實現(xiàn)對葡萄酒酵母的改良.改良后的酵母在葡萄酒酸度調(diào)解、增香、抗氧化、提高功能成分的含量及降低不良物質(zhì)影響等方面具有潛在的應用價值.

6.1 酸度調(diào)整

有機酸是葡萄酒的重要成分之一，其含量影響著葡萄酒的質(zhì)量和口感.北方一些葡萄酒產(chǎn)區(qū)，在葡萄成熟期，氣溫偏低且多雨，這導致葡萄漿果含酸量高，因此降酸就成了葡萄酒釀造中的必要步驟.其中生物降酸既能有效地降低酒的酸度，又增加了葡萄酒的生物穩(wěn)定性，因此成為近年來葡萄酒降酸的主要研究方向.Bony等[8]進行了蘋果酸-乳酸酶基因mleS和粟酒裂殖酵母蘋果酸通透酶基因mae1在釀酒酵母中的共表達研究，結(jié)果表明轉(zhuǎn)化子能徹底降解蘋果酸；李華等[9]通過克隆包含mleA和mleP基因的mle基因座并轉(zhuǎn)化釀酒酵母，使其中的mleA基因得到外源表達，部分L-蘋果酸降解生成乳酸.

6.2 增加香氣

葡萄酒的特征果香成分和典型風格主要來自于葡萄中的香味物質(zhì)，而葡萄漿果中的呈香物質(zhì)(包括非呈香前體)多以糖苷的形式存在于果皮和果汁中，在酒精發(fā)酵過程中，存在于漿果及酵母中的糖苷酶水解糖苷，促進香味物質(zhì)如單萜類物質(zhì)釋放到酒中，但存在于葡萄漿果及釀酒酵母中的糖苷酶種類有限，且受到葡萄糖的強烈抑制，所以人們開始探索運用基因重組手段構(gòu)建水解糖苷能力強的釀酒酵母.Pérez-González等[10]克隆了長臂木霉（Trichodema longibrachiatum）的 β-（1，4）- 內(nèi)切葡聚糖酶基因egl1，使其在葡萄酒酵母T73中表達，Ganga 等[11]將構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）的β-（1，4）-內(nèi)切木聚糖酶基因xlnA拷貝到葡萄酒釀酒酵母中并使其表達，經(jīng)重組酵母發(fā)酵獲得的葡萄酒的果香均有明顯增加.而對于那些萜烯醇含量較少或無香葡萄品種，óscar Herrero等運用代謝工程修飾類異戊二烯的生物合成途徑，將科勒氏酵母（Clarkia breweri）的里那醇合成酶基因在葡萄酒酵母中表達，在微型釀酒實驗中，重組酵母分泌出的里那醇遠遠超出了它的閾值[12].

6.3 抗氧化

白葡萄酒在生產(chǎn)過程中極易發(fā)生褐變，影響其外觀質(zhì)量，工業(yè)上可采用添加SO2、抗壞血酸等方法除祛酒中的氧，防止白葡萄酒氧化，但隨著越來越多的消費者要求無化學添加劑的產(chǎn)品，構(gòu)建能夠分泌葡萄糖氧化酶的基因重組酵母成為一條可利用途徑.Malherbe 等[13]將黑曲霉（Aspergillus niger）的葡萄糖氧化酶基因gox導入釀酒酵母中，構(gòu)建了具備葡萄糖氧化酶活力的基因工程酵母.

6.4 提高功能成分含量

白藜蘆醇主要有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗氧化、抗自由基、保護肝臟、保護心血管和抗心肌缺血等功能，其中,最令人矚目和最有發(fā)展前景的是抗腫瘤作用,被喻為繼紫杉醇之后的又一新的綠色抗癌藥物，而葡萄是白藜蘆醇含量較多的植物之一.為使葡萄中的白藜蘆醇盡可能多的在釀造過程中轉(zhuǎn)入葡萄酒中，Sánchez-Torres等將假絲酵母（Candida molischiana）中編碼β-葡萄糖苷酶的基因bgIN導入葡萄酒釀酒酵母中，并使其表達[14]，隨后González-Candelas等研究發(fā)現(xiàn)，這種重組酵母發(fā)酵生產(chǎn)的葡萄酒中白藜蘆醇的含量明顯升高[15].

6.5 降低不良成分的影響

6.5.1 有害微生物.在葡萄酒的生產(chǎn)過程中，有害微生物的生長會改變產(chǎn)品的化學組成，使其外觀、香氣和風味發(fā)生惡性改變.目前，除加強衛(wèi)生管理外，添加二氧化硫是最常用的防止微生物污染的方式.但面對消費者日益增長的抵制和生物抑菌劑高昂的價格，構(gòu)建嗜殺酵母也是解決問題的有效措施.如編碼雞蛋蛋清溶菌酶基因HEL1、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）的片球菌素基因PED1和明串珠菌屬（Leuconostoc carnosum）的明串珠菌素基因LCA1都已用在具有殺菌能力的工程酵母菌[16].

6.5.2 不安全物質(zhì).葡萄酒的釀造過程中，也會產(chǎn)生某些微量的有害物質(zhì)，如氨基酸的代謝產(chǎn)物與乙醇反應能生成疑有致癌性的化合物氨基甲酸乙酯（ethylcarbamate）.已有研究證實葡萄酒在蘋果酸-乳酸發(fā)酵（MLF）過程中，蘋果酸-乳酸菌（MLB）的精氨酸代謝途徑即精氨酸脫亞氨基酶途徑(Arginine deiminase pathway，簡稱ADI途徑)是產(chǎn)生EC的重要途徑[17].目前法國和阿根廷已經(jīng)完成O.oeni和L.hilgardii的arc簇基因全序列測序，因此除在生產(chǎn)工藝條件上嚴加控制外，是否可以構(gòu)建基因工程菌株來阻斷ADI途徑以降低葡萄酒中此類物質(zhì)的含量有待于進一步的研究.

7 前景與展望

微生物技術(shù)的發(fā)展為葡萄酒工業(yè)奠定了基礎(chǔ)，為葡萄酒酵母的選育提供了更多的可能和選擇空間；同時微生物技術(shù)在二十一世紀為提高葡萄酒的品質(zhì)，降低優(yōu)質(zhì)葡萄酒的生產(chǎn)成本，滿足不同消費者多元的個性化需求做出更大的貢獻.

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1673-260X（2010）06-0157-03