基因疫苗的發(fā)展及其展望

劉斌忠 錫林郭勒職業(yè)學(xué)院 草原生態(tài)與畜牧獸醫(yī)系 026000

基因疫苗,也稱DNA疫苗、核酸疫苗，其作用機(jī)理是將含有可表達(dá)的病原微生物的抗原基因整合到某種適宜的質(zhì)粒DNA中，然后將這種質(zhì)粒DNA直接注射到動物體內(nèi)，使抗原基因利用動物細(xì)胞進(jìn)行內(nèi)源性表達(dá)，從而誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，形成針對病原微生物的免疫保護(hù)作用。

1 基因疫苗的優(yōu)缺點

目前生產(chǎn)上普遍使用的疫苗仍然是傳統(tǒng)的滅活疫苗。這是因為滅活疫苗安全，易隨時制備，但其病毒抗原不能在體內(nèi)增殖，故接種劑量大，免疫時間短，且誘發(fā)細(xì)胞的免疫作用不強。而弱毒疫苗則具有相當(dāng)?shù)膬?yōu)勢，能在動物體內(nèi)進(jìn)行有限的增殖，用量小，成本低，適宜作大量的動物免疫接種，且能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，使機(jī)體產(chǎn)生強而持久的免疫保護(hù)力，但存在毒力不穩(wěn)定的問題，實踐證明有時弱毒疫苗能夠構(gòu)成傳染源，引起疫病流行。由于已有的疫苗存在不少缺點，因此人們一直希望能找到一種更為理想的疫苗?；蛞呙缂染哂袦缁钜呙绲陌踩?，又具有弱毒疫苗的高效性，故很快便在各種疫苗中脫穎而出，倍受廣大研究者的青睞。

2 基因疫苗存在的問題

2.1 接種方式目前已知的接種方法有兩類

一是利用基因槍將質(zhì)粒DNA直接注入皮下、腹膜內(nèi)及骨骼肌等組織；

二是利用高壓放電作用，將質(zhì)粒DNA涂布于金顆粒上，再通過基因槍將其射入相應(yīng)的組織與器官。而對規(guī)?；?、集約化的養(yǎng)殖場而言，這兩種方法顯然都不太適宜，最好能夠研制出相應(yīng)的口服疫苗或氣霧性疫苗，這樣在接種時就方便簡單、省時、省力。

2.2 接種劑量

基因疫苗同其他疫苗一樣，接種量少，抗原基因表達(dá)和提呈的抗原蛋白就少；接種量大，抗原基因表達(dá)和提呈的抗原蛋白就多。又因為其能夠持久表達(dá)，因此很可能會產(chǎn)生各種免疫副作用，如免疫耐受、自身免疫、免疫變態(tài)反應(yīng)等。

2.3 接種途徑Fynan用50～300微克的含甲型流感病毒的HA基因的純化DNA接種2次后,用致死量的同一病毒毒株進(jìn)行致毒,結(jié)果表明經(jīng)肌注、靜脈注射以及粘膜免疫的雞，其保護(hù)率分別為25%～36%、24%、30%。由此可見，不同的組織細(xì)胞攝取質(zhì)粒的能力不同，不同細(xì)胞的傳染效率和表達(dá)外源性基因的能力也存在著差異。

2.4 基因疫苗載體的選擇---質(zhì)粒DNA應(yīng)不具有傳染性,在體細(xì)胞內(nèi)不能復(fù)制,不可整合到細(xì)胞的染色質(zhì)上,但必須能在相應(yīng)的細(xì)菌中高效率地擴(kuò)增和使其攜帶的外源基因能高效率地表達(dá)抗原蛋白,以誘導(dǎo)產(chǎn)生強而持久的免疫保護(hù)力。

3 基因疫苗的免疫機(jī)制

隨著基因疫苗的誕生，國內(nèi)外學(xué)者對其免疫機(jī)制也進(jìn)行了許多研究，但由于研究時間短，故對其具體機(jī)制尚不清楚。目前主要有以下兩種觀點：

3.1 利用基因槍經(jīng)皮膚或粘膜接種后,認(rèn)為在表皮細(xì)胞內(nèi)有專職抗原提呈細(xì)胞APC（酸性磷酸酶）如朗罕氏細(xì)胞等參與活化機(jī)體免疫的過程。

3.2 經(jīng)肌肉接種后，DOE.B等首次證實骨骼來源的APC可將表達(dá)的抗原提呈給T細(xì)胞，誘導(dǎo)出相應(yīng)的CTL（抗腫瘤細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞）反應(yīng)。

4 基因疫苗的安全性評估

基因疫苗受到了廣大研究者的關(guān)注，同時對于其使用安全性也進(jìn)行了一系列的研究，目前主要關(guān)心的問題有：

4.1 引起免疫功能紊亂的可能性基因疫苗能在動物機(jī)體內(nèi)持久地表達(dá)抗原蛋白,從理論上來說，很可能導(dǎo)致免疫耐受、自身免疫、超免疫性等免疫病理現(xiàn)象的發(fā)生。但至今在性成熟動物中尚未有相關(guān)的報道，而在初生動物，Mor.G等將含瘧疾環(huán)狀子孢子蛋白基因接種2-5天的小鼠，產(chǎn)生了特異的免疫耐受狀態(tài)；Wang.Y等將狂犬病毒糖蛋白基因接種出生24小時的小鼠卻誘導(dǎo)出了較強的免疫應(yīng)答。由此可見，動物機(jī)體免疫系統(tǒng)的功能狀態(tài)，質(zhì)粒及抗原的選擇與接種后產(chǎn)生的免疫效果有一定的關(guān)系。因此為了盡量避免產(chǎn)生免疫病理現(xiàn)象，應(yīng)考慮選擇合適的抗原和載體質(zhì)粒DNA以及動物的接種齡期。

4.2 外源基因隨機(jī)整合的可能性質(zhì)粒DNA及其攜帶的外源基因進(jìn)入宿主細(xì)胞后，很可能與細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)隨機(jī)整合，從而致癌。但已有的研究表明，整合的可能性極小。首先基因疫苗注射時，接種量相當(dāng)小，故整合的幾率微乎其微；其次Nichols.W等直接利用PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）方法檢測肌肉接種后細(xì)胞中的質(zhì)粒DNA，未發(fā)現(xiàn)整合。Istwan.D等經(jīng)實驗證實質(zhì)粒DNA進(jìn)入細(xì)胞后并不復(fù)制。另外，畜禽生產(chǎn)周期短，因整合而帶來的危害性更小，甚至可以不予考慮。

4.3 抗DNA抗體產(chǎn)生的可能性曾有報道,在人的自身免疫病(如全身紅斑狼瘡)曾發(fā)現(xiàn)了抗體DNA，故許多人擔(dān)心使用基因疫苗后，可能會產(chǎn)生抗DNA的抗體。Psetsky.Y認(rèn)為利用細(xì)菌DNA免疫接種，可以產(chǎn)生抗哺乳動物ssDNA（變性DNA）抗體，但不產(chǎn)生抗哺乳動物dsDNA（成雙堿基對的DNA）抗體。Xiang.Q等則在實驗中根本沒有檢測到抗DNA的抗體。一般來說，能夠作為免疫原的DNA必須具備復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和較大的分子量，故在制備質(zhì)粒DNA疫苗時，應(yīng)考慮所用質(zhì)粒DNA的結(jié)構(gòu)、分子量的大小及核苷酸的序列等因素。當(dāng)然為了確診基因免疫后能否真正產(chǎn)生抗DNA的抗體，還有待更進(jìn)一步的研究。

5 基因疫苗的接種方案和途徑

5.1 接種方案。DNA疫苗接種的普通方案是連續(xù)注射多次,間隔2-3周,但這種接種方案是可改進(jìn)的。實驗證明，將DNA疫苗與蛋白質(zhì)疫苗交替注射有可能獲得更好的免疫效果。例如給猴子接種HIV-I DNA疫苗以后，再用重組HIV-1（人免疫缺陷病毒I型）的Env（株外膜）蛋白作兩次加強注射，結(jié)果誘導(dǎo)很好的B細(xì)胞和T細(xì)胞免疫反應(yīng)。又例如在結(jié)核桿菌DNA疫苗的研究中，如果預(yù)先給動物接卡介苗，再注射DNA疫苗作為加強劑，對預(yù)防原發(fā)性結(jié)核桿菌復(fù)燃會更有效。

5.2 接種途徑。范泓然在1999年發(fā)現(xiàn),DNA疫苗可以通過毛孔進(jìn)入皮下組織,使小鼠體內(nèi)產(chǎn)生抗乙肝病毒表面抗原的特異性抗體,其效果可以和通常所用的肌肉注射相媲美。

6 基因疫苗和基因免疫的意義和應(yīng)用

6.1 在理論方面,基因疫苗和基因免疫開創(chuàng)了免疫學(xué)的新領(lǐng)域，提出了一個全新的概念，成為當(dāng)前研究的熱點，是最具挑戰(zhàn)性的研究方面。隨著基因免疫研究的深入，人們將能夠了解病原體與疾病免疫的確切關(guān)系，知道一種病原體各種成份誘發(fā)了何種免疫成份的產(chǎn)生。同時有助于更好地理解效應(yīng)免疫的機(jī)制。在實際應(yīng)用方面，基因疫苗也有重要的意義。①基因疫苗的第三次革命。這種第三代疫苗將為預(yù)防傳染性疾病和腫瘤的基因治療等開辟了新的道路。它使疫苗的制備更加科學(xué)合理，通過研究可以知道哪些基因應(yīng)當(dāng)包括進(jìn)DNA疫苗，篩選出能夠誘導(dǎo)出保護(hù)性免疫的抗原成份。②利用基因免疫研究單個蛋白質(zhì)誘導(dǎo)特異免疫反應(yīng)。分離或合成某個蛋白質(zhì)的基因，制備出基因疫苗，研究其初次免疫應(yīng)答的機(jī)制。③基因免疫是生產(chǎn)單克隆抗體的有用技術(shù)。先分離相應(yīng)的基因，構(gòu)建真核表達(dá)載體、免疫后得到抗體。

6.2 基因疫苗研究的主要應(yīng)用：①復(fù)雜微生物、寄生蟲免疫的制備。如結(jié)核桿菌瘧原蟲的抗原成份復(fù)雜，難以純化。通過擴(kuò)增有效抗原成分相對應(yīng)原基因片段，就要簡單得多。②易于變異的微生物，特別是病毒疫苗的制備，如HBV（乙型肝炎病毒）、HCV（丙型肝炎病毒），流感病毒。③制備難以培養(yǎng)或危險的微生物疫苗，如HIV （人類免疫缺陷病毒），HDV（丁型肝炎病毒）。④持續(xù)病毒感染的預(yù)防：LCMV（淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒）、HSV（單純皰疹病毒）。⑤新生兒、兒童免疫接種。⑥胞內(nèi)寄生清除，腫瘤免疫的有效途徑。由于基因疫苗能夠有效刺激CTL（細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞）產(chǎn)生，所以在細(xì)胞免疫方面有重要意義。

7 基因疫苗的國內(nèi)外研究概況及展望

自基因疫苗問世以來，國內(nèi)外學(xué)者便對其免疫機(jī)制、免疫效果、接種方式、使用劑量、安全性及目的基因表達(dá)調(diào)控等進(jìn)行了廣泛而卓有成效的研究。在人醫(yī)方面，愛滋病、人免疫缺陷性病毒及T淋巴瘤的基因疫苗已進(jìn)入了臨床應(yīng)用階段，流感病毒、結(jié)核病、乙型肝炎、丙型肝炎、乳腺癌、肺癌、狂犬病等的基因疫苗也正處于研究之中。在獸醫(yī)方面，國外已有關(guān)于禽流感和新城疫的基因疫苗的報道。在我國，李建偉等報道了基因免疫誘導(dǎo)雞對MDV（馬立克氏病毒）的保護(hù)性反應(yīng)。哈爾濱獸醫(yī)研究所的陳化蘭等報道了基因免疫可誘導(dǎo)SPF（無物定病原）雞抵抗禽流感病毒感染，這些工作為我國畜禽基因疫苗的研究作出了有益的探索。

基因疫苗與其它新技術(shù)疫苗相比具有很多優(yōu)越性，尤其對于養(yǎng)禽業(yè)來說更具有實際意義。眾所周知，很多傳染病的病原具有多個血清型或變異株，例如，一旦爆發(fā)IBD（雞傳染性法氏囊）或AI（禽流感），我們就可以迅速分離病原，克隆其免疫基因，制備針對該病原型的基因疫苗，因而對防治該病更具有針對性。由于常規(guī)的基因克隆技術(shù)已經(jīng)可以在一般實驗室開展，從某種疾病的爆發(fā)到疫苗的制備僅需1-2天即可完成，從這個角度看對基因疫苗的研究應(yīng)該投入更多的精力。然而，目前對于基因疫苗的研究還相當(dāng)有限，尤其是在獸醫(yī)方面，可以說才剛剛起步。有關(guān)基因疫苗的質(zhì)粒選擇，與目的基因調(diào)控有關(guān)的啟動子、增強子、內(nèi)含子和免疫佐劑等的選擇，多個目的基因克隆進(jìn)同一載體后是否產(chǎn)生干擾現(xiàn)象，以及經(jīng)不同途徑接種后引起的免疫效果和免疫機(jī)制機(jī)理等許多問題還有待解決，而一旦這些問題得到了成功的解決，那么就可以設(shè)計研制出大量理想的基因疫苗，為養(yǎng)禽業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展作出不可估量的貢獻(xiàn)。

[1]Curtiss R I,Cardineau CA·O ral immunization by transgenic plants 〔J〕·W orld Plant Application,1990,90：107-111

[2]董偉,易自力·轉(zhuǎn)基因植物口服疫苗研究進(jìn)展〔J〕·動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展·2005,26(6)：6-8

[3]任雪艷,陳創(chuàng)夫等·轉(zhuǎn)基因植物基因工程疫苗的研究進(jìn)展〔J〕·草食家畜(季刊),2004：125·

[4]葛莘·高級植物分子生物學(xué)〔M〕·北京：科學(xué)出版社,2004：93-95·

[5]黃復(fù)深,袁鑫,邱元·植物基因工程疫苗研究進(jìn)展〔J〕·湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 (自然科學(xué)版)·2008,34(2)：215-220·

[6]閆桂琴·生命科學(xué)技術(shù)概論〔M〕·北京：科學(xué)出版社,2003：88-91·

[7]田佳,賈會勇,李杰·植物可食疫苗研究現(xiàn)狀與展望〔J〕·中國生物制品學(xué)雜志,2008,21(7)：637-640

[8]劉一萍,邵中軍,徐德忠,等.HBsAg陽性孕婦及其新生兒用HBIG對乙型肝炎病毒母嬰傳播的阻斷效果觀察[J].疾病控制雜志,2004,8(2)：109-111.

[9]王克恭.基因免疫—傳染病防治研究的新熱點[J].畜牧與飼料科學(xué)，1998，19（2）：45-47