植酸酶轉(zhuǎn)基因動物的研究進展

王 爽 冷義福 張守純 沈陽農(nóng)業(yè)大學68號信箱，遼寧沈陽 110161

植酸酶是近年來開發(fā)和應用的一類新環(huán)保型飼料添加劑，它能將飼料中豐富的植酸及其絡合物分解為能被畜禽利用的無機磷和肌醇，提高了飼料潛在的營養(yǎng)價值和畜禽機體骨骼礦化程度，降低畜禽糞便中磷的排放量從而減輕對環(huán)境的污染[1]。由于動物營養(yǎng)和環(huán)保的原因需要在飼料中添加植酸酶，而植酸酶是催化植酸水解成肌醇與磷酸的一類酶的總稱，有植物、動物和微生物3種來源，根據(jù)其理化性質(zhì)分為酸性、堿性和中性植酸酶，不同來源的植酸酶最適反應溫度不同，大多數(shù)有不耐熱的缺點。因此開發(fā)熱穩(wěn)定性較好的植酸酶是當務之急[2]。

1 植酸酶的理化性質(zhì)

植酸酶的理化性質(zhì)因其來源不同，最適pH值、最適溫度和熱穩(wěn)定性等方面有一定差異。

1.1 植酸酶的最適pH值

植物來源的植酸酶最適pH值一般在5～7之間，在pH3.0時，大多數(shù)植酸酶活性下降、甚至失活，不適合在酸性環(huán)境下起作用。細菌來源的植酸酶最適pH值一般為中性或偏堿性。真菌植酸酶的最適pH值為2.5～7.0。黑曲霉NRRL3135能產(chǎn)生兩種不同的植酸酶，一株最適pH值為5.5和2.5(phyA)，另一株最適pH為2.0(phyB)，兩種菌株發(fā)酵和生產(chǎn)的植酸酶，經(jīng)體外試驗發(fā)現(xiàn)：在pH值為2.5和5.5時活性最強，可能是因為pH為2.5時，與胃中的酸堿度相接近；pH為5.5時屬于腸道pH值變化范圍內(nèi)(夏立秋，2001)。 Newman D(1994)等人在1994年發(fā)現(xiàn)由Aspergi11us niger產(chǎn)生的植酸酶在pH為5.0～6.5時，具有最強的活性。另外，也有堿性植酸酶最適pH值為8.0的報道?？傊?，不同來源的植酸酶最適pH值存在差異。

1.2 植酸酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性

植酸酶的最適溫度在40℃～60℃范圍內(nèi)，不同來源植酸酶的最適溫度相差也較大。由于飼料加工的制粒工藝中有一個短暫的高溫過程，溫度在75℃～93℃之間，一般的植酸酶活性在此高溫下不可避免的發(fā)生失活。從嗜溫微生物中分離到的高溫植酸酶其最適溫度在70℃～80℃，雖然有很好的耐溫性，但它在37℃下的酶活性極低，沒有使用價值；而來源于黑曲霉等的植酸酶在37℃下具有較高酶活性，但它又不能經(jīng)受制粒時的高溫。所以能在飼料中真正得到推廣利用的植酸酶必須是具有良好的熱穩(wěn)定性[3]。目前，在酶的耐熱性方面已有許多富有成效的研究，一種較簡單而有效的方法就是采用酶的包被技術(shù)，將酶包裹在包衣中免受制粒高溫的破壞，包衣在動物胃中可被消化而釋放出酶。歐洲的一種常用方法是把液態(tài)植酸酶制劑灑在制成的顆粒料上，或使用冷壓制?！，F(xiàn)有酶的包被、緩釋技術(shù)，可以同時解決酶的耐高溫以及保持高酶活的問題，但是加工成本較高，難以大批量地應用于生產(chǎn)。所以，如何使酶既能短暫耐高溫又能在動物體中具有高活性，是目前飼料用植酸酶制劑急需解決的一個問題[4]。

2 植酸酶應用現(xiàn)狀

2.1 植酸酶作為飼料添加劑的應用

到目前為止，植酸酶雖然在飼料中作為飼料添加劑得到廣泛的推廣應用，但仍然存在一些缺點∶1.植酸酶的抗逆性，尤其是熱穩(wěn)定性即高溫失活(80℃)不能滿足飼料及飼料加工的要求。加工飼料都需經(jīng)過一個制粒工藝，在制粒過程中有一個短暫的高溫過程，溫度大多在75～93℃，一般的植酸酶活性在此高溫度下大幅度地不可逆喪失[5];2.飼料用酶又必須在常溫下具有較高的酶活性，因為飼料用酶最終的作用場所是動物正常體溫(37℃左右)的胃腸道中，這與工業(yè)上所使用的一些高溫酶不同;3.從噬溫微生物等中分離到的高溫植酸酶其最適溫度70～80℃，雖然具有較好的耐溫性，但它在37℃下酶的活性極低，在飼料中沒有利用價值;4.儲存過程中酶活性的喪失等諸多因素的限制等[6]。

2.2 植物基因工程生產(chǎn)植酸酶的應用

利用植物轉(zhuǎn)基因工程來生產(chǎn)植酸酶也正在發(fā)展階段。目前，在煙草種子[7]、大豆[8]中獲得表達植酸酶的轉(zhuǎn)基因植物。然而，在制粒和儲存過程中仍然存在酶活穩(wěn)定性問題。降低植物飼料中植酸含量的植物基因工程研究也正獲得進展，例如，植酸含量降低65%的轉(zhuǎn)基因玉米[9]，能夠降低飼料中添加植酸酶的量，但是，如果向飼料中添加無機磷對豬和家禽的生長還是有好處。低植酸轉(zhuǎn)基因谷物的發(fā)展?jié)摿€不能肯定，因為與對照相比，低植酸含量谷物表現(xiàn)為發(fā)芽率低和產(chǎn)量下降[10]。

3 植酸酶轉(zhuǎn)基因動物

植酸酶的熱穩(wěn)定性研究目前還處于知識積累階段，目前還很難取得大的突破。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展尤其是轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)技術(shù)的提高，為這些問題的解決提供了一條有效的新途徑，通過豬和禽類等單胃動物的內(nèi)源性消化道來產(chǎn)生具有較高生物活性的內(nèi)源性植酸酶已經(jīng)成為解決單胃動物高磷糞便污染的一種研究策略和手段。

內(nèi)源性的植酸酶可以增加植物植酸鹽的生物學活性，并可以降低動物生產(chǎn)中磷的排出，解決環(huán)境污染和環(huán)境生態(tài)的難題，也解決了轉(zhuǎn)基因植物中飼料加工和貯存酶失活等問題，同時由于植酸鹽的分解解除了其抗營養(yǎng)作用，可以促進動物的生長發(fā)育，提高飼料利用率。在這方面Go1ovan等在小鼠的唾液腺中表達了E.co1i植酸酶基因appA產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)在唾液中含有糖基化的蛋白。唾液腺中植酸酶的表達導致糞便中磷的降低，這表明它提供了一種減少動物飼料中磷的添加以及畜牧中磷污染的途經(jīng)，已經(jīng)以唾液腺為生物反應器做了成功的嘗試，使轉(zhuǎn)基因小鼠和豬等單胃動物糞便中磷含量大大地降低[11]?？梢哉f通過轉(zhuǎn)基因動物自身分泌內(nèi)源性的植酸酶來解決這些問題，是一種一勞永逸的方法。

3.1 植酸酶基因在動物體內(nèi)的表達系統(tǒng)

（1）唾液腺生物反應器

唾液腺生物反應器是一類最近才發(fā)展起來的新型生物反應器。其特點是利用唾液分泌蛋白的調(diào)控區(qū)在唾液腺中特異性表達各種酶類和人類基因治療的蛋白。常用的唾液分泌蛋白為腮腺分泌蛋白PSP,a-唾液淀粉酶a-Amy和富含脯氨酸的蛋白Pro-rich。Mastrange1i等利用腺病毒調(diào)控的a抗胰蛋白酶基因載體轉(zhuǎn)染唾液腺，結(jié)果導致a抗胰蛋白酶在唾液中表達。利用唾液腺生物反應器在表達人基因治療蛋白方面也獲得了很大進展，M ikke1sen等利用小鼠腮腺分泌蛋白基因的調(diào)控區(qū)構(gòu)建人血凝結(jié)因子V111表達載體，在小鼠的唾液腺中成功地表達了人血凝結(jié)因子Vi11。這些結(jié)果為唾液腺作為生物反應器的可行性研究做了有效的嘗試[12]。

（2）唾液腺生物反應器的優(yōu)勢

唾液腺組織分泌物很容易通過導管進入到口腔;唾液腺細胞能夠合成和分泌大量的蛋白∶唾液中合成和分泌的物質(zhì)能夠源源不斷進入到體內(nèi);唾液的分泌不受性別和發(fā)育時期的限制，動物的一生都分泌唾液，而且大家畜的唾液分泌量大，容易收集純化;另外，唾液腺生物反應器不像血液生物反應器受所表達蛋白的種類限制。正是唾液腺的這些突出的特色，使得唾液腺生物反應器越來越呈現(xiàn)出勃勃生機，被寄于厚望用唾液腺表達一些飼料中需添加的酶類，如植酸酶、葡糖昔酶、木聚糖酶等，來改善家畜和家禽的生產(chǎn)性狀，對整個畜牧產(chǎn)業(yè)是非常重要。

（3）植酸酶在唾液腺生物反應器的表達

在單胃動物，如豬、雞和鴨等家禽產(chǎn)業(yè)上，植酸酶的添加非常迫切，主要是由于單胃動物體內(nèi)缺乏內(nèi)源性植酸酶，使飼料中的植酸磷不能被有效分解、吸收，而隨糞便排放出，造成了嚴重的農(nóng)業(yè)磷污染[13]。Go1ovan等建立了可以在唾液腺中分泌植酸酶的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。該研究中所采用的表達系統(tǒng)為由可誘導的大鼠富脯氨酸蛋白(inducib1epro1inerichprotein,PRP)啟動子和小鼠組成型腮腺分泌蛋白(constitutive parotidsecretoryproten,PSP)啟動子來調(diào)控的大腸桿菌植酸酶appA墓因在唾液腺中的表達。該基因所編碼的植酸酶己倍證實對于禽類的植酸鹽作用效果非常明顯。通過對轉(zhuǎn)基因小鼠的分析被證實對于禽類的植酸鹽作用效果非常明顯。通過對轉(zhuǎn)基因小鼠的分析結(jié)果表明，所生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因小鼠的唾液腺中植酸酶的分泌可以導致小鼠糞便中磷水平的顯著降低。該實驗室用同樣的系統(tǒng)獲得了植酸酶轉(zhuǎn)基因豬，其糞便中磷含量降低了56-67%，大大緩解環(huán)境中磷污染 (Go1ovan SP.et a1.,2001)。其轉(zhuǎn)基因表達的效果可以通過與非轉(zhuǎn)基因豬的對比研究闡明，在以豆粉為唯一的磷源時，轉(zhuǎn)基因豬在斷奶仔豬和育成豬的磷消化率幾乎達到了100%，而非轉(zhuǎn)基因豬只有50%[14]。而對糞便的檢測中，與非植酸酶轉(zhuǎn)基因豬相比較，植酸酶轉(zhuǎn)基因豬的糞便磷含量在斷奶仔豬和育成豬分別降低了56%和75%飼料利用率有明顯的提高，而且通過轉(zhuǎn)基因豬所產(chǎn)生的植酸酶對植物中所含有的植酸鹽的水解作用完全可以替代無機磷的添加[15]。

4 展望

轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)自產(chǎn)生之日起就顯示出勃勃生機，并被寄予厚望。一方面希望可以利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)作為動植物育種的強有力工具，將符合人類期望的優(yōu)良性狀基因通過生物工程手段使之重組于某些動物品種，以期改良動物的生產(chǎn)性狀;另一方面轉(zhuǎn)基因技術(shù)在生命科學的諸多領(lǐng)域也顯示出巨大的潛力[16]。近年來，動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展的相當迅速，轉(zhuǎn)基因豬的技術(shù)也己經(jīng)非常成熟。因此植酸酶轉(zhuǎn)基因動物對內(nèi)源性植酸酶降低糞便磷代謝，解決單胃動物糞便中高磷污染,提高植酸酶的熱穩(wěn)定性，這些問題最有前途和最有利的方法，為建立一種可持續(xù)發(fā)展的農(nóng)業(yè)動物飼養(yǎng)模式，并育成環(huán)保型畜禽提供應用前景和商業(yè)價值。

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