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    集落刺激因子對慢性腦缺血成年鼠膠質(zhì)細胞可塑性及記憶改善的影響

    2010-08-15 00:42:18舒細記柳威周紅艷熊巍鵬陳艷華艾永循
    中國實用醫(yī)藥 2010年32期
    關鍵詞:胞質(zhì)可塑性星形

    舒細記 柳威 周紅艷 熊巍鵬 陳艷華 艾永循

    有關慢性腦缺血損傷后認知障礙的康復治療一直是臨床熱點,以往多關注神經(jīng)細胞的修復對認知預后的影響。目前研究發(fā)現(xiàn),膠質(zhì)細胞的修復對認知功能改善的作用同樣至關重要,膠質(zhì)細胞可以通過改變自身特性以適應內(nèi)外環(huán)境的損傷刺激而具有可塑性,包括細胞數(shù)量的增加,細胞胞體突起長度上的變化,非星狀及放射狀細胞向星形膠質(zhì)細胞的形態(tài)轉(zhuǎn)化等,其中以細胞胞體突起長度變化最為明顯[1]。膠質(zhì)細胞可塑性在神經(jīng)信息傳遞、整合和調(diào)控等促進認知改善的過程中起關鍵作用[2]。重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)對于造血細胞的生長和分化起重要介導作用,具有刺激骨髓干細胞遷移、增殖、分化、成熟等生物學功能。本研究構(gòu)建慢性腦缺血模型,從膠質(zhì)細胞可塑性改變及學習記憶功能改善的角度,探討rhG-CSF對慢性腦缺血損傷的修復作用。

    1 材料與方法

    1.1 建模與分組 3月齡雄性清潔級SD大鼠45只,體重(287±37)g,隨機分為缺血組、對照組和干預組,每組15只。1%戊巴比妥鈉35~40 mg/kg麻醉大鼠,分離并結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈,作為缺血組。假缺血的對照組僅分離雙側(cè)頸總動脈但不結(jié)扎。大鼠術(shù)后再常規(guī)飼養(yǎng)6個月,期間有8只死亡,最后存活鼠缺血組11只、對照組14只、干預組12只。干預組rhG-CSF(齊魯制藥公司產(chǎn)品)的劑量為10 μg/kg;缺血組、對照組采用生理鹽水作為安慰劑,均皮下注射,手術(shù)6個月后連續(xù)3 d,停藥5 d,完成學習記憶功能評估后立即處死大鼠,取材制片。

    1.2 學習記憶功能評估 通過定位航行實驗評估大鼠空間學習能力,空間探索實驗評估大鼠空間記憶能力。評估實驗前1 d,讓大鼠在無逃逸平臺的水池中適應性游泳2 min。定位航行實驗:連續(xù)5 d,每天上午同一操作者將大鼠面向池壁從不同象限入水,找到平臺后站立15 s,記錄其找到隱匿平臺所耗的逃逸時間,再從平臺上移開休息60 s后進行下一輪實驗。若在120 s內(nèi)大鼠未找到平臺,由操作者引導上平臺,逃逸時間記為120 s??臻g探索實驗:完成定位航行實驗后撤去平臺,將大鼠從平臺所在的對面象限中放入水池,記錄2 min內(nèi)大鼠穿過平臺所在區(qū)域的次數(shù)及停留于平臺所在象限的時間。

    1.3 海馬膠質(zhì)細胞可塑性的圖像分析 4%多聚甲醛全身灌注固定,取含海馬結(jié)構(gòu)的組織制片。免疫組化染色采用即用型GFAP抗體及PV-9000試劑盒完成。設PBS為一抗陰性對照、已知陽性切片為陽性對照,GFAP以細胞質(zhì)出現(xiàn)棕色顆粒為陽性。采用MOTIC Med 6.0分析系統(tǒng)進行圖像分析。在海馬CA1區(qū)隨機選定起始區(qū)后連續(xù)采集5個“400?”視野,以“個/視野”為單位記錄GFAP陽性細胞數(shù)。同時,每個高倍視野隨機選取10個形態(tài)明確胞質(zhì)突起完整的GFAP陽性細胞,記錄每個待測細胞最長胞質(zhì)突起的長度(μm)。

    2 結(jié)果

    2.1 rhG-CSF對空間學習記憶能力的影響 定位航行實驗中,隨著訓練天數(shù)的增加,各組大鼠找到隱匿平臺的逃逸潛時間逐漸減少(表1)。缺血組的整體逃逸時間明顯多于對照組(P<0.01),干預組逃逸時間明顯少于缺血組(P<0.01)。空間探索實驗中,缺血組大鼠停留于平臺所在象限的時間(12.16±4.33)較對照組(19.32±5.41)明顯減少(P<0.05),缺血組大鼠穿過平臺的次數(shù)(4.36±1.95)較對照組(11.08±3.74)明顯減少(P<0.01)。干預組大鼠停留于平臺所在象限的時間(15.76±4.53)明顯高于缺血組(P<0.05),干預組大鼠穿過平臺的次數(shù)(8.47±2.71)明顯多于缺血組(P<0.05)。

    2.2 海馬CA1區(qū)的膠質(zhì)細胞可塑性觀察 就膠質(zhì)細胞數(shù)量變化而言,缺血組(28.67±5.97)海馬CA1區(qū)GFAP陽性細胞數(shù)目較對照組(59.48±8.63)明顯減少(P<0.01),干預組海馬CA1區(qū)GFAP陽性細胞(39.25±4.83)較缺血組明顯增多(P<0.05)。就膠質(zhì)細胞胞質(zhì)突起變化而言,缺血組海馬CA1區(qū)GFAP陽性細胞胞質(zhì)突起的平均長度(167.57±35.74 μm)較對照組(256.74±45.27 μm)明顯縮短(P <0.05),干預組GFAP陽性細胞的胞質(zhì)突起平均長度(196.43±26.83 μm)較缺血組明顯延長(P<0.05)。

    2.3 大鼠空間記憶能力與膠質(zhì)細胞可塑性的相關性分析 各組大鼠海馬CA1區(qū)GFAP陽性細胞胞質(zhì)突起長度的變化與對應的平臺所在象限停留時間(r=0.615,F(xiàn)=0.613,P<0.05)、穿過平臺區(qū)域次數(shù)的變化趨勢(r=0.601,F(xiàn)=0.637,P<0.05)均呈正相關;各組海馬CA1區(qū)GFAP陽性細胞數(shù)量的變化與對應的平臺所在象限停留時間(r=0.681,F(xiàn)=6.409,P<0.05)、穿過平臺區(qū)域次數(shù)的變化趨勢(r=0.749,F(xiàn)=9.512,P <0.05)呈正相關。

    3 討論

    慢性腦缺血是血管性癡呆、Alzheimer、Binswanger等多種慢性腦血管病的共同病理過程,可致器質(zhì)性中樞神經(jīng)損傷和功能性認知障礙。rhG-CSF作為一種多潛能的造血生長因子,可動員外周血骨髓干細胞向中樞系統(tǒng)遷移,分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞,修復中樞系統(tǒng)損傷。海馬是腦缺血損傷最敏感的區(qū)域之一,與學習記憶等認知功能密切相關。本研究著重探討rhG-CSF對慢性腦缺血后海馬膠質(zhì)細胞可塑性及記憶功能的影響。

    星形膠質(zhì)細胞為最主要的膠質(zhì)細胞,GFAP是星形膠質(zhì)細胞的特異性分子標記物。本研究通過病理組織學觀察分析星形膠質(zhì)細胞可塑性發(fā)現(xiàn),對照組GFAP陽性細胞數(shù)量最多、胞質(zhì)突起長度最長,干預組次之,缺血組GFAP陽性細胞數(shù)量最少、胞質(zhì)突起分支少而短小,部分GFAP陽性細胞胞質(zhì)突起崩解。通過定位航行實驗發(fā)現(xiàn),干預組大鼠逃逸時間顯著低于缺血組,提示rhG-CSF干預后慢性腦缺血大鼠學習障礙明顯改善??臻g探索實驗發(fā)現(xiàn),干預組大鼠平臺所在象限的停留時間及跨越平臺次數(shù)均顯著高于缺血組,提示rhG-CSF治療后大鼠記憶障礙明顯改善。由此證實,rhG-CSF可有效改善慢性腦缺血大鼠的認知障礙。對照組與缺血組、干預組與缺血組的GFAP陽性細胞數(shù)量及胞質(zhì)突起長度的組間分析,均有統(tǒng)計學差異,前者提示慢性腦缺血對星形膠質(zhì)細胞的損傷,后者提示rhG-CSF可有效促進缺血海馬的星形膠質(zhì)細胞可塑性變化。

    本研究對膠質(zhì)細胞可塑性與認知記憶改善趨勢的進一步相關性分析發(fā)現(xiàn),各組GFAP陽性細胞的數(shù)量及其胞質(zhì)突起長度變化,與大鼠停留于平臺所在象限的時間、穿過平臺區(qū)域次數(shù)均呈正相關,提示rhG-CSF可通過激活星形膠質(zhì)細胞數(shù)量增生、胞質(zhì)突起長度延長等可塑性變化,來促進大鼠空間記憶能力的改善。新生星形膠質(zhì)細胞可為神經(jīng)細胞遷移提供腳手架,神經(jīng)細胞軸突生長沿星形膠質(zhì)細胞突起形成的架橋爬行遷移,形成有效的軸突通路。同時,新生星形膠質(zhì)細胞可釋放出興奮性氨基酸、前列腺素等神經(jīng)活性物質(zhì),調(diào)控神經(jīng)元的功能[3],促進神經(jīng)元間突觸網(wǎng)路的建立,增加傳導速度[4]。星形膠質(zhì)細胞還在突觸發(fā)生、突觸傳遞的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要功能[5],是神經(jīng)信息傳遞、整合和調(diào)控過程中的關鍵角色[2],rhG-CSF干預后的膠質(zhì)細胞可塑性變化,可能是學習記憶損害后功能改善的重要病理修復機制之一。但rhG-CSF通過誘導膠質(zhì)細胞可塑性變化來改善認知障礙的神經(jīng)信號傳導機制,還有待進一步深入研究。

    [1]商永華,王群,陸兵勛,等.慢性腦缺血大鼠學習記憶變化及甲狀腺激素的影響.中國康復醫(yī)學雜志,2007,22(3):209-211.

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