一種優(yōu)良半矮稈水稻品種的分離與分子鑒定＊

林建中，楊遠(yuǎn)柱，趙小英，唐冬英，周 波，杜長(zhǎng)青，劉選明?

（1.湖南大學(xué) 生物學(xué)院，化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410082；2.湖南亞華種業(yè)科學(xué)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410001）

矮稈或半矮稈性狀是包括水稻（OryzasativaL.）在內(nèi)的禾谷類作物的重要性狀之一.矮稈或半矮稈作物不僅提高抗倒伏能力，而且不影響穗的育性和結(jié)實(shí)率，從而提高了作物產(chǎn)量[1].眾所周知的導(dǎo)致糧食產(chǎn)量大幅提高的“綠色革命”就是由于培育和大規(guī)模推廣高產(chǎn)的半矮稈水稻品種所帶來的一場(chǎng)作物綠色革命.

赤霉素（gibberellin，GA）在調(diào)節(jié)植物的許多生理過程，如種子萌發(fā)、莖的伸長(zhǎng)、花和果實(shí)的發(fā)育等方面起著非常重要的作用[2－4].迄今為止，從水稻分離的與赤霉素有關(guān)的突變體被歸為3類：細(xì)長(zhǎng)型突變體、GA非敏感型突變體和GA敏感型突變體[5－6].細(xì)長(zhǎng)型突變體表現(xiàn)出一種組成型的持續(xù)激活的GA響應(yīng)模式，而矮稈突變體則出現(xiàn)GA生物合成途徑或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的缺失.如細(xì)長(zhǎng)型水稻突變體slr1－1是由一個(gè)隱性單基因控制，并導(dǎo)致組成型的GA敏感表型[7].隱性的GA非敏感型矮稈突變體d1是由于其異源三聚體G蛋白的α－亞單位突變，導(dǎo)致GTP結(jié)合蛋白無法傳遞赤霉素信號(hào)，使GA不能正常發(fā)揮作用，從而導(dǎo)致極端矮稈性狀，而且外源GA處理不能使莖伸長(zhǎng)[8].同時(shí)，Ueguchi－Tanaka等[8]在水稻中鑒定了一種赤霉素不敏感的矮化突變體gid1，而GID1過量表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致對(duì)赤霉素超敏感.這些研究結(jié)果表明，赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑受阻使得赤霉素對(duì)植株生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)得不到有效執(zhí)行，從而導(dǎo)致植株矮化.

在水稻中，許多GA敏感型矮稈突變體及其相應(yīng)基因已經(jīng)被分離和鑒定.如突變體dx和d18分別為內(nèi)根－貝殼杉烯氧化酶和GA3氧化酶發(fā)生突變，導(dǎo)致體內(nèi)活性GA1的含量降低[9－10].半矮稈突變體sd－1是由于 GA20氧化酶－2基因 （Os－GA20ox－2）突變導(dǎo)致 GA20氧化酶－2活性喪失，體內(nèi)活性GA1的含量降低[11－13].該突變性狀增加了抗倒伏能力和產(chǎn)量，廣泛應(yīng)用于水稻育種，被譽(yù)為“綠色革命”.另一個(gè) GA20氧化酶基因（Os－GA20ox－1）也已被分離和克隆，發(fā)現(xiàn)特異性抑制該基因表達(dá)可以導(dǎo)致矮化[14].另外，一個(gè)Ds標(biāo)記的水稻敏感型矮稈突變體已被分離，發(fā)現(xiàn)是由于GA合成的第二步催化過程中的內(nèi)根－貝殼杉烯合成酶（KS）被破壞所致[15].這些結(jié)果表明，赤霉素敏感型矮稈突變體是由于赤霉素生物合成途徑中某一關(guān)鍵酶的活性降低或喪失，從而阻礙了赤霉素的生物合成和代謝，導(dǎo)致內(nèi)源GA含量顯著降低.因此，該突變類型亦稱GA缺陷型矮稈突變體.該類絕大部分突變體呈現(xiàn)明顯的矮化，外施GA可恢復(fù)其正常表型.

株1S是一種中國南方雜交水稻育種廣泛應(yīng)用的優(yōu)良兩系光溫敏雄性核不育系[16].它具有育性轉(zhuǎn)換臨界溫度低、高抗逆性和廣親和性等特點(diǎn).但是其株高偏高，抗倒伏能力差，容易導(dǎo)致雜交后代因倒伏而減產(chǎn).為了改良該農(nóng)藝性狀，采用無性系誘變育種方法選育了優(yōu)良矮化突變株系SV1S和SV14S[17].本研究中，我們從形態(tài)、生理和分子水平對(duì)矮化突變株系SV1S和SV14S進(jìn)行了研究，以期闡明SV突變株系矮化的原因.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

株1S為湖南省株州市農(nóng)科所培育的秈型光溫敏核不育水稻，SV1S和SV14S為本研究組利用體細(xì)胞無性系變異篩選的半矮稈突變體.另外，2個(gè)粳稻品種日本晴和黃殼糯在Southern雜交實(shí)驗(yàn)中用作對(duì)照.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 半矮稈突變體的分離

從株1S中分離2～3cm長(zhǎng)的幼穗，經(jīng)表面消毒后接種于 MS＋2，4－D 2.0mg／L培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織.3周后將誘導(dǎo)的愈傷組織轉(zhuǎn)移至 MS＋6－BA 0.2mg／L＋2，4－D 2.0mg／L繼代培養(yǎng).4周后將繼代培養(yǎng)后的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接至 MS＋2，4－D4.0mg／L培養(yǎng)3周左右，然后轉(zhuǎn)移至 MS＋6－BA 2.0mg／L誘導(dǎo)芽的分化.分化苗再轉(zhuǎn)移至MS＋NAA 0.5mg／L＋I(xiàn)AA 0.5mg／L進(jìn)行生根培養(yǎng)2周，待根長(zhǎng)好后煉苗1周，最后移栽至大田中.所有組織培養(yǎng)條件為16h光照和8h黑暗，溫度為（25±2）℃.分化苗（R0）移栽至大田中，抽穗期套袋自花受粉，成熟期單株收種.體細(xì)胞無性系突變體（SV）表型的初步鑒定按文獻(xiàn)[17]的方法在R1和R2代進(jìn)行.

1.2.2 半矮稈突變體表型的鑒定

SV突變體的表型鑒定于R2代進(jìn)行.由于不育狀態(tài)的不育系水稻有旗葉鞘包穗現(xiàn)象，對(duì)植株高度的測(cè)量影響很大[18－19].因此，SV突變體及其親本株1S都必需經(jīng)低溫處理恢復(fù)育性后方能測(cè)量株高和節(jié)間長(zhǎng)度.SV突變體及其親本株1S于冬季種植于海南陵水育種基地，利用低溫（20℃左右）恢復(fù)育性，于成熟期測(cè)量株高及各節(jié)間長(zhǎng)度.

莖的組織解剖學(xué)觀察按照張全芳等[20]的方法進(jìn)行.于抽穗期分別取株1S和SV14S的第IV節(jié)間進(jìn)行石蠟切片，然后于奧林巴斯光學(xué)顯微鏡下觀察并照相.

1.2.3 外源GA3對(duì)幼苗伸長(zhǎng)的影響

將種子用0.1%的HgCl2消毒5～6min，蒸餾水沖洗3次后15℃下再浸種24h，放入光照培養(yǎng)箱中35℃催芽24h.等種子露白后再播于盛有蛭石的瓷盤中，30℃培養(yǎng)3d后，分別以7種不同濃度（1×10－10mol／L，1×10－9mol／L，1×10－8mol／L，1×10－7mol／L，1×10－6mol／L，1×10－5mol／L，1×10－4mol／L）的GA3溶液每天澆苗的基部，并以清水澆苗的基部作為對(duì)照，直至第一葉停止生長(zhǎng)為止，比較播后第6d的第二葉鞘長(zhǎng)度.每種材料各個(gè)濃度測(cè)量40株，去掉最高和最矮苗后，測(cè)量38株苗的第二葉鞘長(zhǎng)度.另外，測(cè)量播種后第7d的幼苗高度.同樣是每種材料各個(gè)濃度測(cè)量40株，去掉最高和最矮苗后，測(cè)量38株苗的高度.

1.2.4 外源GA3對(duì)無胚半粒種子α－淀粉酶的誘導(dǎo)

參照 Ueguchi－Tanaka等[8]的方法準(zhǔn)備無胚半粒種子和α－淀粉酶的誘導(dǎo).首先配制0.2%淀粉－2%瓊脂培養(yǎng)基，高壓蒸汽滅菌.滅菌后，待培養(yǎng)基冷卻至60℃左右，于超凈工作臺(tái)上在部分培養(yǎng)基中加入GA3，至終濃度為10－6mol／L.然后將含GA3和不含GA3培養(yǎng)基分別倒入滅菌培養(yǎng)皿中，冷卻后備用.挑選飽滿水稻種子，去掉穎殼，用70%的酒精滅菌1～2min，0.1%的 HgCl2浸泡10～15 min，再用無菌水沖洗5次，在無菌條件下將種子切成兩段，挑取無胚半粒段分別均勻地置入含GA3和不含GA3培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿平板中，每培養(yǎng)皿放置6粒種子.30℃培養(yǎng)4d后，加I－KI指示劑到培養(yǎng)皿中，2～3min后傾出I－KI指示劑，用蒸餾水沖洗瓊脂表面，然后觀察種子周圍出現(xiàn)的透明圈，并測(cè)量透明圈的大小.每種材料在不同培養(yǎng)基上共處理30粒種子，即5個(gè)培養(yǎng)皿平板.

1.2.5 RFLP分析

采 用 CTAB（cetyltrimethylammonium bromide）法[21]提取葉片基因組DNA.參照 Motoyuki等[22]的方法進(jìn)行限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性[Restriction fragment length polymorphism （RFLP）]分析.基因組DNA（20μg）經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoRI酶切過夜后，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分離，再轉(zhuǎn)移至尼龍膜上.按照Spielmeyer等[12]的方法采 用 正 向 引物 （5’－GCGCCAATGGGGTAATTAAAACG－3’）和反向引物（5’－GGCATTCCATTGTTTGTGATTGG－3’）從GA20ox－2 基 因 中 擴(kuò)增的634bp片段作為雜交用的探針.探針采用α－32P－ATP標(biāo) 記.在 0.25mol／L Na2HPO4，1.0 mmol／L EDTA和7%SDS溶液中于65℃雜交過夜.在2×SSC，0.1%SDS溶液中于65℃洗膜15 min，共洗膜2次，然后再于0.2×SSC，0.1%SDS溶液中于65℃洗膜15min.

1.2.6 序列分析

已有研究表明，GA20ox－2 基因（GenBank accession no.AY114310）有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，定位于1號(hào)染色體上[11－13].為了得到GA20ox－2的旁鄰序列，以GA20ox－2的序列在基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行了BLAST搜索，結(jié)果在粳稻品種日本晴基因組數(shù)據(jù)庫中搜索到人工細(xì)菌染色體（BAC）克隆AP003561（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／entrez／viewer.fcgi？db＝nuccore＆id＝16191728）以及秈稻品種9311基因組數(shù)據(jù)庫中搜索到scalffold000946（http：／／rise.genomics.org.cn／rice／jsp／report／scaffReport.jsp？scaffold＿id＝3550＆organism＝9311）與GA20ox－2的序列相匹配.然后以軟件Primer Premier 5.0分析GA20ox－2基因及其旁鄰序列的HindIII和EcoRI的酶切位點(diǎn).

1.2.7GA20ox－2的表達(dá)分析

采用Trizon RNA提取試劑盒（Invitrogen）從葉片中提取總RNA.首先采用半定量RT－PCR分析GA20氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄水平.GA20ox－1（GenBank acces－sion no.U50333）的半定量RT－PCR引物序列為：正向引物（F）為5’－CGTCACCTGCAACCAACAAT－3’；反向引物（R）為5’－GATGGGTACGTGCAAACCAA－3’.GA20ox－2（GenBank accession no.AY114310）的半定量RT－PCR引物序列為：正向引物（F）為5’－TACTACAGGGAGTTCTTCGCGGACAGCA－3’；反向引物（R） 為 5’－TGTGCAGGCAGCTCTTATACCTCCCGTT－3’.作為內(nèi)參的水稻肌動(dòng)蛋白基因Actin（GenBank accession no.X16280）的半定量RT－PCR引物序列為：正向引物（F）為5’－CTGGGTTCGCCGGAGATGAT－3’；反向引物 （R）為 5’－TGAGATCACGCCCAGCAAGG－3’.

隨后采用熒光定量PCR（QPCR）進(jìn)一步驗(yàn)證GA20氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄水平.QPCR在MX3000熒光定量PCR儀上進(jìn)行，以染料ROX作為參比熒光強(qiáng)度，具體操作步驟見 Costa等[23]的方法.GA20ox－2的QPCR引物與半定量RT－PCR一樣，但是GA20ox－1和Actin基因的QPCR引物作了相應(yīng)改變.GA20ox－1的QPCR引物序列為：正向引物（F）為5’－AATGAGCATGGTGGTGCAGCAGGAGCAG－3’；反向引物 （R）為 5’－GTTAACCACCAGGAAGAAGCCGTGCCTC－3’.Actin的QPCR引物序列為：正向引物（F）為5’－AGTCTGACCCATCCATTGTGC－3’；反向引物（R）為5’－TTGTCCACGCTAATCAAGAAAC－3’.值得說明的是，所有引物都設(shè)計(jì)在相應(yīng)基因cDNA的3’端.

2 結(jié)果與分析

2.1 矮稈突變體的分離和表型分析

株1S植株偏高，節(jié)間較長(zhǎng)，其雜交后代抗倒伏性較差.已有研究表明[24]，在植物組織培養(yǎng)中，體細(xì)胞容易產(chǎn)生突變，所以采用體細(xì)胞無性系誘變方法篩選半矮稈突變體，以期降低株1S的高度.通過約2～3個(gè)月的愈傷組織誘導(dǎo)、繼代和分化，得到了24個(gè)具有明顯不同于親本株1S的獨(dú)立分化植株（R0）.在 R1代發(fā)現(xiàn)2個(gè)突變株系SV1S和SV14S表現(xiàn)出半矮稈性狀，并且其他農(nóng)藝性狀仍然比較優(yōu)良.經(jīng)過R2和R3代的后續(xù)表型分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)SV突變株系的半矮稈性狀沒有出現(xiàn)分離，說明通過體細(xì)胞誘變的方法成功獲得了性狀穩(wěn)定的半矮稈突變體.除了植株高度變矮之外，SV1S和SV14S的表型與親本株1S基本沒有差異（圖1）.更重要的是，突變體仍然保留了株1S的優(yōu)良性狀，包括光溫敏不育的生理特性（數(shù)據(jù)未列出）.

圖1顯示了親本株1S和SV突變體的植株形態(tài)和高度.從圖可知，植株高度按株1S，SV14S和SV1S的順序從78.5cm逐漸降低為60.3cm.同時(shí)分析了株1S和SV14S的各節(jié)間長(zhǎng)度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與親本株1S相比，SV14S的基部節(jié)間長(zhǎng)度明顯縮短，而上部節(jié)間幾乎沒有變化（圖2（a）和（b））.該性狀不僅提高了抗倒伏能力，而且有助于產(chǎn)量的增加.另外，進(jìn)一步觀察了位于基部的IV節(jié)間橫切面，發(fā)現(xiàn)SV14S節(jié)間直徑和節(jié)間壁厚度均顯著大于親本株1S（圖2（c））.結(jié)果說明，突變體SV14S增加了抗倒伏能力，有助于提高產(chǎn)量.

圖1 SV突變體的表型.SV突變體和株1S經(jīng)低溫（20°C）處理后恢復(fù)育性，于成熟期測(cè)量植株高度.Fig.1 Phenotype of theSVmutants.The parent Zhu1Swas used as control.All mutants and Zhu1S restored the fertility after treatment with low temperature（20 ℃）and the height of plants were measured at the ripening stage

2.2 SV突變體對(duì)外源GA表現(xiàn)出正常的敏感性

赤霉素的一個(gè)重要生理功能是促進(jìn)水稻苗的生長(zhǎng)[25－26].為了確定所獲得的半矮稈突變體是否與GA有關(guān)，我們檢測(cè)了其GA敏感性特征.在缺乏外源赤霉素時(shí)SV突變體的幼苗和親本株1S高度幾乎相同，而施加外源GA3時(shí)SV突變體的幼苗卻比對(duì)照親本高（圖3（a））.結(jié)果表明，SV1S和SV14S幼苗對(duì)外源赤霉素表現(xiàn)出正常的敏感性.同時(shí)，還研究了外源GA3對(duì)第二葉鞘長(zhǎng)度的影響，發(fā)現(xiàn)SV突變體和親本株1S的第二葉鞘均對(duì)不同濃度GA3敏感，其伸長(zhǎng)程度都非常相似（圖3（b））.該結(jié)果進(jìn)一步證明，SV突變體在葉鞘的生長(zhǎng)方面也對(duì)GA敏感.

圖2 SV14S和株1S各節(jié)間的比較.（a）和（b）SV14S基部節(jié)間（圖右）明顯縮短.Ⅰ－Ⅳ，分別表示自穗而下的各節(jié)間.標(biāo)尺，5cm.（c）株1S（圖上）和SV14S（圖下）Ⅳ節(jié)間的橫切面的顯微觀察.標(biāo)尺，1mm.SV14S和株1S經(jīng)低溫（20℃）處理后恢復(fù)育性，于成熟期進(jìn)行檢測(cè)Fig.2 Comparison of the internodes ofSV14Sand Zhu1S.（a）and（b）Typical compaction of lower internodes inSV14Splants（right）.Ⅰ－Ⅳ，the respective internodes from top to bottom.Scale bar，5cm.（c）Anatomical observation of the transverse section of theⅣinternodes of Zhu1S（above）andSV14S（low）.Scale bar，1mm.BothSV14Sand Zhu1Srestored the fertility after treatment of low temperature（20 ℃）and the observation were performed at the ripening stage

另外，還研究了外源赤霉素對(duì)無胚半粒種子α－淀粉酶的誘導(dǎo)特性（圖3（c））.研究發(fā)現(xiàn)，在含GA3的淀粉平板中SV突變體和親本株1S的無胚半粒種子周圍均產(chǎn)生了明顯的暈圈，說明都有α－淀粉酶誘導(dǎo).但是在不含GA3的淀粉平板中SV突變體和株1S都沒有產(chǎn)生暈圈.該結(jié)果表明SV突變體和親本株1S無胚半粒種子的α－淀粉酶都能被外源GA3誘導(dǎo)，進(jìn)一步證明了SV突變體對(duì)外源赤霉素敏感，其半矮稈性狀可能是由于活性GA的缺失引起的.然而與親本株1S相比，SV突變體的暈斑數(shù)目較少，暈斑的大小也較小，說明在組織培養(yǎng)過程中SV突變體中可能還有其他與赤霉素合成無關(guān)的基因產(chǎn)生了突變，從而導(dǎo)致在GA敏感性和植株高度方面產(chǎn)生了微小差異.綜合以上生理研究結(jié)果可以得知，SV1S和SV14S矮化性狀不是由于赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑缺失引起的，很可能是由于赤霉素生物合成途徑的缺失或其他突變導(dǎo)致的.

圖3 SV突變體對(duì)外源GA3的反應(yīng)（a）GA3處理對(duì)株1S（◆），SV1S（■）和SV14S（▲）幼苗伸長(zhǎng)的影響.M mol／L.（b）GA3處理對(duì)株1S（◆）V1S（■）和SV14S（▲）第二葉鞘伸長(zhǎng)的影響.M mol／L.（c）無胚半粒種子的α－淀粉酶的誘導(dǎo).Zhu1S和SV突變體的無胚半粒種子置于含有10－6mol／L GA3（＋）和不含GA3的淀粉平板上.淀粉用碘染色檢測(cè).Fig.3 Response of theSVmuants to exogenous GA3（a）Elongation of the seedlings in reponse to GA3 treatment.Zhu1S（◆），SV1S（■）andSV14S（▲）.M mol／L.（b）Elongation of the second leaf sheath in reponse to GA3treatment.Zhu1S（◆），SV1S（■）andSV14S（▲）.M mol／L.（c）α－amylase induction in embryoless half seeds.Embryoless half seeds from Zhu1SandSVmutants were placed on starch plates with（＋）or without（－）10－6mol／L GA3.Starch was detected by staining with iodine

2.3 SV突變體的GA20ox－2基因中的一段缺失引起該基因的表達(dá)量降低

鑒于本研究中SV突變體的表型與已知sd－1突變體非常類似，所以我們采用Spiel Meyer等[12]的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）方法首先研究了SV突變體的GA20ox－2基因.采用PCR方法從親本株1S的GA20ox－2中克隆了一段長(zhǎng)634bp片段作為探針.在RFLP雜交圖譜中，SV突變體和親本株1S間有明顯的譜帶差異（圖4（a）和（b））.當(dāng)基因組DNA以限制性內(nèi)切酶HindIII酶切后，親本株1S雜交條帶出現(xiàn)在約4.4kb位置，而SV突變體雜交條帶小約200bp，出現(xiàn)在4.2kb位置（圖4（a））.該結(jié)果表明在SV突變體GA20ox－2中存在一個(gè)約200bp片段的缺失.另外還發(fā)現(xiàn)，2個(gè)野生型粳稻品種日本晴和黃殼糯的雜交條帶出現(xiàn)在4.6 kb位置，比秈稻品種株1S雜交條帶大200bp左右.該結(jié)果意味著在秈稻和粳稻GA20ox－2區(qū)域間存在約200bp的差異.當(dāng)基因組DNA以EcoRI酶切后，在野生型對(duì)照品種株1S、日本晴和黃殼糯中均出現(xiàn)2條分別為2.3kb和1.1kb雜交條帶，但是在SV突變體中僅出現(xiàn)一條約3.1kb雜交條帶（圖4（b））.這些結(jié)果表明在SV突變體GA20ox－2中存在一段約200bp的缺失，并導(dǎo)致GA20ox－2中的一個(gè)EcoRI酶切位點(diǎn)消失.同時(shí)，在基因組中也檢測(cè)到了另外一個(gè)GA20氧化酶基因.在RFLP的雜交圖譜中，雜交信號(hào)比較弱的條帶（8kb，圖4（a）；23kb，圖4（b））可能就是另一個(gè)定位在3號(hào)染色體上的GA20氧化酶基因（GA20ox－1；GeneBank accession no.U50333）[14].

圖4 Southern blot分析.（a）HindIII酶切的基因組DNA.（b）EcoRI酶切的基因組DNA.從株1S基因組DNA中擴(kuò)增來的GA20ox－2的外顯子2用α－32P－ATP標(biāo)記作為探針.粳稻品種黃殼糯（H）和日本晴（N）以及親本株1S（Z）用作對(duì)照.1，SV1S；14，SV14S.（c）在scalffold000946中的GA20ox－2基因及其旁鄰區(qū)域的EcoRI和HindIII的酶切圖譜分析.外顯子用黑框表示，內(nèi)含子和5’，3’端的非編碼區(qū)用線條表示.粗線段代表探針.每個(gè)限制性內(nèi)切酶上方的數(shù)字代表相應(yīng)的酶切位點(diǎn).位點(diǎn)39371＊顯示粳稻和秈稻間本就有的237bp的缺失差異.Fig.4 Southern blot analysis.（a）HindIII－digested genomic DNA.（b）EcoRI－digested genomic DNA.The exon2ofGA20ox－2amplified from genomic DNA of Zhu1Swas used as the probe and labeled withα－32P－ATP.Thejaponicalvarieties，Huangkenuo（H）and Nipponbare（N），and the parent Zhu1S（Z）were used as the contol.SV1S（1）andSV14S（14）.（c）Schematic diagram of theEcoRI andHindIII restriction map around the region ofGA20ox－2gene in scalffold000946.Exons are shown as black boxes；introns and the non－coding region of 5’and 3’terminal are shown as lines.The thick line represents the probe.The numbers on the each restriction enzyme represent the corresponding positions.The site 39371＊shows the original 237bp deletion inindicarice compared withjaponicaones.

為了進(jìn)一步驗(yàn)證以上RFLP結(jié)果的可靠性，對(duì)粳稻和秈稻GA20ox－2及其旁鄰序列的HindIII和EcoRI酶切位點(diǎn)進(jìn)行了分析.圖4（c）顯示了GA20ox－2區(qū)域EcoRI和HindIII酶切位點(diǎn)的限制性圖譜.基于限制性圖譜和所用探針序列的分析，在HindIII酶切的雜交圖譜中預(yù)計(jì)會(huì)出現(xiàn)有4412 bp雜交帶，而在EcoRI酶切的雜交圖譜中會(huì)出現(xiàn)2條分別為2376bp和1105bp雜交帶.正如上面所描述的一樣，親本株1S的RFLP研究結(jié)果與預(yù)期結(jié)果完全一致，而SV突變體RFLP結(jié)果與預(yù)期結(jié)果不同.實(shí)際上，通過來自秈稻品種9311的scalffold000946和來自粳稻品種日本晴的BAC克隆AP003561的序列分析發(fā)現(xiàn)，在scalffold000946的39371位點(diǎn)有一個(gè)237bp片段的缺失，位于GA20ox－2 5’端的非編碼區(qū).這個(gè)在秈稻和粳稻間固有的差異導(dǎo)致在HindIII酶切RFLP雜交圖譜中，株1S的雜交條帶比粳稻品種日本晴和黃殼糯小約200bp.所以這個(gè)秈稻和粳稻間固有的237bp差異可以作為陽性對(duì)照，從而推知與親本株1S相比較SV突變體GA20ox－2中存在一個(gè)約200bp的缺失突變.基于以上結(jié)果推知，在2個(gè)SV突變體GA20ox－2中存在約200bp的缺失突變，導(dǎo)致GA20ox－2中4316位點(diǎn)的EcoRI酶切位點(diǎn)消失.根據(jù)Ashikari等人[27]的報(bào)道，已有4個(gè)sd－1等位基因被分離和鑒定出來.一個(gè)來源于低腳烏尖和IR8的sd－1等位基因存在一個(gè)383bp片段缺失，導(dǎo)致了移碼突變而提前產(chǎn)生了終止密碼子.其他3個(gè)分別來源于Jikkoku，Reimei和Calrose 76的sd－1等位基因均分別在不同位點(diǎn)出現(xiàn)了點(diǎn)突變，從而造成了一個(gè)氨基酸的改變.在本研究中，SV突變體GA20ox－2中出現(xiàn)了約200bp缺失突變，該突變不同于已報(bào)道的4個(gè)sd－1等位基因，說明該突變基因是一個(gè)新的sd－1等位基因.

另外，還分析了GA20氧化酶基因GA20ox－1和GA20ox－2在親本株1S和SV突變體間的表達(dá)差異（圖5）.首先通過半定量RT－PCR分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GA20ox－1在株1S，SV1S和SV14S中都有很高的表達(dá)量，而在親本株1S和突變體SV1S，SV14S間卻沒有明顯差異.相反，GA20ox－2在突變體SV1S和SV14S中表達(dá)量很低，而在親本株1S中表達(dá)量較高.隨后QPCR分析也得到了同樣的結(jié)果，進(jìn)一步證實(shí)了GA20ox－2在親本和突變體SV1S，SV14S間的表達(dá)差異性（圖5（b），（c））.綜合以上結(jié)果，我們認(rèn)為SV突變體GA20ox－2的缺失突變?cè)斐闪嗽摶虮磉_(dá)量的降低，使植株體內(nèi)活性赤霉素含量減少而導(dǎo)致矮稈性狀.

圖5 在SV突變體和株1S中GA20ox的表達(dá)分析.（a）GA20ox－1（U50333）和GA20ox－2（AY114310）的半定量 RT－PCR分析.（b）GA20ox－1的定量PCR分析.GA20ox－2的定量PCR分析.肌動(dòng)蛋白基因（X16280）由來為對(duì)照.Fig.5 Expression analysis ofGA20oxgene inSVmuants and Zhu1S.（a）Semi－quantitative RT－PCR analysis ofGA20ox－1（U50333）andGA20ox－2（AY114310）.（b）Quantitative real time PCR analysis ofGA20ox－1.（c）Quantitative real time PCR analysis ofGA20ox－2.Actin gene（X16280）was used as a control.

3 討 論

體細(xì)胞無性系誘變經(jīng)常在生產(chǎn)中用于改良作物品種.本研究獲得的2個(gè)突變體具有不同的半矮稈表型，其中SV14S保留了親本株1S的大多數(shù)優(yōu)良農(nóng)藝性狀[17]，表明SV14S是一個(gè)理想的半矮稈光溫敏不育系，將來在水稻雜交育種中很有可能取代親本株1S，具有很高的應(yīng)用價(jià)值.該優(yōu)良突變體的成功誘變和篩選充分說明了體細(xì)胞無性系誘變具有比較溫和的突變特性，能夠用于改良在生產(chǎn)中具有很高品質(zhì)和商業(yè)價(jià)值但是又具有某種不良性狀的水稻品種，從而培育出更為優(yōu)良的新品種.

迄今為止，在水稻中已經(jīng)有超過60個(gè)矮稈突變體被分離和鑒定出來，并且把它們歸為赤霉素缺陷型矮稈突變體、赤霉素非敏感型矮稈突變體和其他原因造成的矮稈突變體[29].例如，突變體dx，d18和sd－1是赤霉素合成途徑的缺陷導(dǎo)致活性赤霉素GA1含量降低而造成矮稈[9－10].突變體d1和gid1在赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中出現(xiàn)缺陷而導(dǎo)致對(duì)赤霉素表現(xiàn)出不敏感而造成矮稈[8].突變體d61和d2已分別被確認(rèn)為是在油菜素內(nèi)酯（BR）信號(hào)受體和油菜素內(nèi)酯生物合成途徑的基因發(fā)生突變而導(dǎo)致矮稈性狀[8，27].

赤霉素GA20氧化酶是赤霉素生物合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，它催化一系列的氧化反應(yīng)并消除C－20，為催化GA合成途徑最后一步反應(yīng)的酶GAβ－羥基化酶（GA3ox）提供底物[30].在水稻中，編碼GA20氧化酶的2個(gè)基因GA20ox－1和GA20ox－2已經(jīng)被鑒定出來.其中特異性抑制GA20ox－1的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致植株高度的矮化[9，14].更重要的是，被譽(yù)為“綠色革命基因”的GA20ox－2功能的缺失而造成的sd－1矮稈突變體也被分離和鑒定出來[11－13].迄今為止，已有4個(gè)sd－1的等位基因被分離和鑒定.一個(gè)來源于低腳烏尖和IR8的sd－1等位基因存在一個(gè)383bp片段的缺失，導(dǎo)致了移碼突變而提前產(chǎn)生了終止密碼子.其他3個(gè)分別來源于Jikkoku，Reimei和Calrose 76的sd－1等位基因均分別在不同位點(diǎn)出現(xiàn)了點(diǎn)突變，從而造成了一個(gè)氨基酸的改變，導(dǎo)致所編碼的GA20氧化酶部分功能的缺失.在本研究中，SV突變體GA20ox－2基因中出現(xiàn)了約200bp缺失突變，該突變不同于已報(bào)道的4個(gè)sd－1等位基因，說明該突變基因是一個(gè)新的sd－1等位基因.

植株高度，特別是半矮稈性狀，經(jīng)常被認(rèn)為是一個(gè)數(shù)量性狀并受到多種遺傳因素的影響.在研究中，發(fā)現(xiàn)2個(gè)SV突變體在GA20ox－2基因中都存在約200bp缺失，說明2個(gè)突變體最初來源于組織培養(yǎng)中的同一個(gè)突變細(xì)胞.然而，2個(gè)突變株系在植株高度和α－淀粉酶對(duì)外源赤霉素敏感性方面又存在差異，這意味著在愈傷組織的繼代、分化和突變株的分離篩選過程中2個(gè)突變株系間還有另外一個(gè)微效基因發(fā)生了突變.

與親本株1S相比，盡管SV突變體在GA20ox－2基因中出現(xiàn)了約200bp缺失突變，導(dǎo)致該基因表達(dá)量降低，而且在成熟期表現(xiàn)出明顯的半矮稈性狀.但是，在幼苗期當(dāng)缺乏外源赤霉素時(shí)，親本株1S和SV突變體都具有相同的植株高度，而且SV突變體在水稻種子糊粉層α－淀粉酶的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中還表現(xiàn)出了對(duì)外源赤霉素敏感性的降低.這些生理性狀均與已報(bào)道的sd－1突變體有所不同[11－13].因此，我們猜想在SV突變體中還存在另一個(gè)突變位點(diǎn)，使得SV突變體與所報(bào)道的sd－1突變體有所差異.目前，我們從SV14S與一個(gè)高稈秈稻恢復(fù)系ZR02的雜交后代中篩選到了一個(gè)新型半矮稈光溫敏雄性不育系湘陵628S.該品種已經(jīng)通過了湖南省品種審定，被確認(rèn)為超級(jí)雜交早稻的優(yōu)良母本.與我們所預(yù)期的結(jié)果一樣，湘陵628S株高72cm左右，并且發(fā)現(xiàn)在該突變體中因?yàn)殡s交而丟失了GA20ox－2突變位點(diǎn)，恢復(fù)為正常GA20ox－2，從而使得其株高高于母本SV14S，而矮于“祖母”株1S.這進(jìn)一步證實(shí)了可能存在的另一個(gè)突變位點(diǎn)造成了湘陵628S的株高與其母本SV14S和“祖母”株1S間的差異.當(dāng)前，我們正在對(duì)湘陵628S中的突變位點(diǎn)進(jìn)行圖譜定位和克隆，以期進(jìn)一步了解該突變株系的矮稈突變分子機(jī)制.

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