抑制Raf-MEK-ERK信號(hào)傳導(dǎo)途徑上調(diào)食管癌細(xì)胞株EC9706柯薩奇-腺病毒受體的表達(dá)

劉 霞，馮 婷，趙繼敏，李 沛，黃幼田，楊洪艷，趙明耀，董子明

(鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，河南 鄭州 450052)

眾多生物分子能引起正常細(xì)胞惡變，參與腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、抗凋亡等重要的生物學(xué)過(guò)程。理解這些分子的作用及相互影響有助于提高腫瘤的診斷率和治療率?？滤_奇-腺病毒受體(coxsackie and adenovirus receptor，CAR)因?yàn)橄俨《据d體基因治療的興起而備受重視。研究表明，CAR不僅具有同種抗原黏附、白細(xì)胞游出、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)等生理功能，而且在腫瘤發(fā)生和侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中也扮演著很重要的角色[1]。近年來(lái)研究表明，腺病毒作為溶瘤病毒或基因治療的載體用于惡性腫瘤的治療，其臨床療效在很大程度上受CAR的影響，上調(diào)CAR可以增強(qiáng)治療效果。然而，腫瘤細(xì)胞中的CAR常常呈現(xiàn)低表達(dá)或者缺失，因此，人們嘗試用各種方法提高腫瘤細(xì)胞表面CAR表達(dá)。Rauen等[2]研究表明細(xì)胞E-cadherin的表達(dá)情況與RAS激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)MAPK通路激活狀態(tài)有關(guān)，而在臨床腫瘤組織中CAR的表達(dá)模式又與E-cadherin的表達(dá)相似。在本研究中，作者用一定濃度的抑制劑抑制 Raf-M EK-ERK信號(hào)傳導(dǎo)途徑，觀察食管癌EC9706細(xì)胞膜表面CAR的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人食管癌細(xì)胞EC9706由鄭州大學(xué)病理生理教研室提供，RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó) Hy Clone公司，胎牛血清購(gòu)于杭州賽樂(lè)生物科技有限公司，胰蛋白酶購(gòu)于美國(guó)Hykelone公司，RT-PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，總 RNA提取試劑T rizol購(gòu)自Invitrogen公司，瓊脂糖購(gòu)自 BIO BASIC公司，兔抗人CAR單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，p44/42(137F5)ERK(1/2)兔抗人單抗購(gòu)自美國(guó)，Cell Signaling Technology公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔 IgG(H+L)購(gòu)自北京鼎國(guó)生物公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將食管癌EC9706細(xì)胞置于RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，青霉素100 u/m L，鏈霉素100 u/m L)中37℃、5%CO2孵箱內(nèi)貼壁培養(yǎng)，2～3 d傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。待細(xì)胞匯合至80%時(shí)，更換新鮮培養(yǎng)基并分組。實(shí)驗(yàn)組分為10、20、40μmol/L單純ERK抑制劑PD98059處理組，對(duì)照組為等體積的RPMI-1640培養(yǎng)基，作用24 h收集細(xì)胞。

1.3 免疫熒光檢測(cè)EC9706細(xì)胞CA R表達(dá) 用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered sodium，PBS)清洗長(zhǎng)有細(xì)胞的蓋玻片3次，輕輕吸去殘余液體;室溫用40 g/L多聚甲醛(溶于0.01 mol/L PBS，p H為 7.2～7.4)固定細(xì)胞 30 min，PBS沖洗細(xì)胞3次，每次5 min;用含 50 g/L牛血清清蛋白(bovine serum albumin，BSA)的封閉液封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，室溫靜置30 min;用含50 g/L BSA的PBS稀釋一抗，吸凈蓋玻片的液體，勿洗，將稀釋后的一抗滴加至蓋玻片上，濕盒中靜置，4℃過(guò)夜，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。PBS沖洗細(xì)胞 3次，每欠5 min;用含50 g/L BSA的PBS稀釋FITC標(biāo)記的二抗，滴加二抗稀釋液至玻片上，室溫避光孵育1 h，熒光下顯微鏡觀察。以胞膜上出現(xiàn)綠色熒光顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，應(yīng)用 Biosens Digital Imaging System灰度掃描分析其陽(yáng)性面積百分比及陽(yáng)性區(qū)平均灰度，檢測(cè)CAR的表達(dá)水平。

1.4 RT-PCR檢測(cè)EC9706細(xì)胞CAR m RNA的表達(dá) 嚴(yán)格參照Trizol試劑盒說(shuō)明書從分組并處理好的EC9706細(xì)胞中提取總 RNA。以隨機(jī)六合引物1μL做逆轉(zhuǎn)錄引物，2μL RNA在AMV的作用下合成cDNA第一鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3 μL做PCR模板進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)PCR表達(dá)的上游引物為TTC AGG TGC GAG ATG TTA，下游引物為 GAA TGA TTA C TG CCG ATG。PCR反應(yīng)條件:95 ℃、30 s，54 ℃、30 s，74℃、1 min，30個(gè)循環(huán)，最后 72℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物各 2 μL在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳。凝膠成像儀掃描分析電泳結(jié)果，檢測(cè)CAR m RNA的表達(dá)水平。

1.5 Western blot檢測(cè) EC9706細(xì)胞 CAR、ERK、p-ERK(1/2)的表達(dá) 參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》提取EC9706細(xì)胞總蛋白，測(cè)定濃度后，在標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線下算出50μg蛋白上樣量，以β-actin為內(nèi)參照，Western blot檢測(cè) EC9706細(xì)胞表面CAR、ERK、p-ERK(1/2)的表達(dá)。50μg上樣量蛋白分別用 8%、12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行垂直電泳分離后，“三明治法”轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含50 g/L BSA搖床封閉3 h，加入1∶1000 p44/42(137F5)MAP Kinase兔抗人一抗，4℃過(guò)夜。用TBS T洗滌3次后加入1∶5000稀釋的二抗孵育1 h后，再用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行X線膠片曝光顯影，在完成對(duì)ERK的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)后將該膜在蒸餾水中漂洗5 min，加入適量的Western一抗、二抗去除液，漂洗5 min后加入1∶1000稀釋的 p44/42(137F 5)ERK(1/2)兔抗人單抗，4℃孵育過(guò)夜，用 TBST洗滌3次后加入 1∶5000稀釋的二抗孵育 1 h后，再用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行X線膠片曝光顯影進(jìn)行p-ERK(1/2)檢測(cè)，用同樣方法將一抗換成兔抗人CAR單克隆抗體進(jìn)行CAR檢測(cè)，用Gel-Doc圖像分析軟件檢測(cè)各條帶的灰度值，將不同濃度處理組的灰度值與對(duì)照組灰度值進(jìn)行比較分析。每組至少重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 多樣本均數(shù)采用單因素方差分析，S PSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫熒光檢測(cè)不同濃度處理組EC9706細(xì)胞CAR的表達(dá) 封2圖 1顯示，與對(duì)照組比較，10μmol/L PD98059組與對(duì)照組綠色熒光顆粒CAR蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而20、40μmol/L PD98059組綠色熒光顆粒CAR蛋白的表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，隨著抑制劑濃度的增加，綠色熒光顆粒CAR蛋白的表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，并且隨著抑制劑濃度的增加CAR蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)。

2.2 RT-PCR檢測(cè)不同濃度處理組EC9706細(xì)胞CAR m RNA的表達(dá) 圖2顯示，與對(duì)照組比較，10μmol/L PD98059組CAR m RNA的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而20、40μmol/L PD98059組表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且隨著抑制劑濃度的增加CAR m RNA的表達(dá)明顯上調(diào)。

2.3 抑制ERK(1/2)的磷酸化引起EC9706細(xì)胞CAR蛋白表達(dá)上調(diào) 圖3顯示，與對(duì)照組比較，Western-blot檢測(cè) 10 μmol/L PD98059組EC9706細(xì)胞p-ERK(1/2)和CAR蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但 20、40μmol/L PD98059組EC9706細(xì)胞p-ERK(1/2)表達(dá)明顯下降，而CAR蛋白的表達(dá)顯著提高，且隨著抑制劑濃度的增加EC9706細(xì)胞p-ERK(1/2)的表達(dá)越發(fā)下降，而CAR蛋白的表達(dá)提高更加顯著(P＜0.05)。

圖2 RT-PCR檢測(cè)PD98059作用于EC9706細(xì)胞后CAR的表達(dá)

圖3 Western-blot檢測(cè) PD98059作用于EC9706細(xì)胞后p-ERK(1/2)和CAR的表達(dá)

3 討 論

隨著基因治療理論和技術(shù)的發(fā)展，腺病毒作為溶瘤病毒或基因治療的載體已被廣泛用于惡性腫瘤的治療。復(fù)制選擇性腺病毒(replication-selective adenoviruses)以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)成為腫瘤病毒治療研究最為廣泛的病毒之一。它是通過(guò)遺傳工程改造使其能通過(guò)特異性在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制、裂解腫瘤細(xì)胞、而對(duì)正常的細(xì)胞無(wú)殺傷力的溶瘤病毒。作為基因?qū)胼d體最常用的是Ad2和Ad5，而CAR是 Ad5和 Ad2的受體[3]，它在不同組織來(lái)源腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平很不相同，甚至在同一組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)也差異極大。盡管CAR真正的生物學(xué)功能還不十分清楚，但有關(guān)CAR表達(dá)的調(diào)節(jié)在以Ad載體為基礎(chǔ)的基因治療應(yīng)用卻非常廣泛?；蛑委熓峭ㄟ^(guò)替代有功能缺陷的關(guān)鍵基因或矯正缺陷基因，從而改變細(xì)胞的惡性表型以達(dá)到治療疾病的目的，重組Ad載體具有轉(zhuǎn)染效率高，攜帶外源基因容量大等優(yōu)點(diǎn)，但許多研究表明腺病毒載體的感染效率受到靶細(xì)胞表面CAR蛋白表達(dá)水平的限制[4-8]。若細(xì)胞CAR的表達(dá)水平低于一定閾值時(shí)，腺病毒的轉(zhuǎn)染能力就會(huì)受到影響，導(dǎo)致腺病毒基因治療效果下降甚至無(wú)效。為解決這些缺陷，通過(guò)各種方法增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞表面CAR的表達(dá)成為增加腺病毒感染效率的重要手段[9-12]，找到有效調(diào)節(jié)CAR的方法，就可解決基因治療過(guò)程中某些腫瘤組織Ad轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低下的難題。近年研究表明CA R表達(dá)的缺失至少部分是通過(guò)癌基因信號(hào)傳導(dǎo)途徑[13-15]，蛋白 E-cadherin和 ZO-1的表達(dá)缺失可以通過(guò)抑制Ras激活ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路引起表達(dá)上調(diào)，而同樣作為細(xì)胞黏附分子的CAR是否也能通過(guò)該通路的改變引起表達(dá)的上調(diào)呢?已報(bào)道Raf-MEK-ERK信號(hào)傳導(dǎo)途徑與許多病毒感染有關(guān)，病毒感染靶細(xì)胞可激活該信號(hào)傳導(dǎo)途徑;Raf-MEK-ERK信號(hào)傳導(dǎo)途徑活化后又可進(jìn)一步促進(jìn)病毒的復(fù)制增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和存活。作為多種生長(zhǎng)因子(EGF、NGF、PDGF等)的下游蛋白，ERK 信號(hào)途徑在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起中介和放大信號(hào)的作用，一方面接受大量來(lái)自生長(zhǎng)因子、絲裂原、環(huán)境刺激等的信號(hào)，另一方面通過(guò)ERK信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)作用于核轉(zhuǎn)錄因子如AP-1、NF-κB等，調(diào)控基因表達(dá)。許多受體Tyr蛋白激酶及與G蛋白耦聯(lián)的細(xì)胞因子受體都可激活胞內(nèi)Ser-Thr蛋白激酶，即MAPKs(mitogen-activated Protein kinases)，而CAR胞內(nèi)域也存在 Tyr磷酸化位點(diǎn)。因此，本文嘗試通過(guò)抑制Raf-MEK-ERK信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)上調(diào)食管癌EC9706細(xì)胞CAR表達(dá)?？傊彻馨〦C9706細(xì)胞表面CA R的表達(dá)可通過(guò)抑制Raf-MEK-ERK信號(hào)傳導(dǎo)途徑而上調(diào)，但具體抑制劑的濃度和抑制效果與細(xì)胞類型有關(guān)

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