BMP2活性多肽/鼠尾Ⅰ型膠原復(fù)合物植入異位成骨的實(shí)驗(yàn)研究

李景峰 鄭啟新 郭曉東 盧宏偉 林振宇 蘭生輝

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院骨科，武漢 430022)

引言

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)是目前能夠誘導(dǎo)骨組織形成的一類局部生長(zhǎng)因子，其中以 BMP2的成骨能力最強(qiáng)[1]。本課題組自行設(shè)計(jì)并合成的 BMP2活性多肽是根據(jù)天然BMP2具有誘導(dǎo)成骨功能的核心功能區(qū)設(shè)計(jì)合成的含24個(gè)氨基酸的寡肽，在前期的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究中，已證明其具有與BMP2類似的骨誘導(dǎo)活性[2-3]。

膠原支架材料被認(rèn)為是骨形態(tài)發(fā)生蛋白載體的金標(biāo)準(zhǔn)[4]。鼠尾Ⅰ型膠原作為天然的生物材料，在結(jié)構(gòu)和抗原性方面與人體組織的Ⅰ型膠原基本相同;同時(shí)膠原支架材料的三維空間結(jié)構(gòu)具有一定的強(qiáng)度以及適宜的孔徑，保持了天然的滲透性，對(duì)BMP2活性多肽可以起到錨定和支持作用，為細(xì)胞增殖和功能分化提供合適的微環(huán)境[5-6];而且它來(lái)源廣泛，成分較為單一，制備比較方便[7]，是構(gòu)建組織工程支架的良好原料。本實(shí)驗(yàn)利用鼠尾Ⅰ型膠原作為BMP2活性多肽的載體，植入大白鼠股四頭肌肌袋，驗(yàn)證與評(píng)價(jià)BMP2活性多肽誘導(dǎo)成骨能力，為下一步臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 鼠尾Ⅰ型膠原

實(shí)驗(yàn)所用膠原為酸溶性鼠尾膠原，其主要成分為Ⅰ型膠原，參照文獻(xiàn)的方法[7-8]進(jìn)行提取，具體方法為：①?gòu)男迈r大鼠尾尾根部切斷鼠尾，置于75%乙醇中浸泡30 min，抽出尾腱至于平皿中;②抽取的肌腱浸入70%酒精中浸泡20 min，剪碎，三蒸水清洗轉(zhuǎn)移至0.5%乙酸中，每根鼠尾約250 mL，攪拌48 h，充分溶解;③冷凍離心，20000 r/min，20 min后取上清液;④1 mol/L NaOH滴定上清液，p H=7.0時(shí)，離心，20000 r/min，20 min取沉淀;⑤冷凍干燥(-60℃);⑥根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要量將適量?jī)龈珊笫笪并裥湍z原溶解成膠凍狀，保存于4℃冰箱中備用。

1.2 BMP2活性多肽

本課題組自行設(shè)計(jì)的BMP2活性多肽通過(guò)芴甲基羰基/叔丁氧基(FMOC/tBu)固相多肽合成法合成：采用對(duì)堿不穩(wěn)定的9-芴甲基羰基保護(hù)氨基酸的α-氨基，采用對(duì)酸不穩(wěn)定的叔丁基型或其它保護(hù)基團(tuán)保護(hù)氨基酸的側(cè)鏈官能團(tuán)，用聚酰胺樹(shù)脂作為多肽合成的固相載體。所得粗肽經(jīng)過(guò)凝膠層析初步純化，最后經(jīng)過(guò)高效液相色譜法純化，冷凍而得。經(jīng)過(guò)高效液相色譜法純化后純度為96.8%，通過(guò)質(zhì)譜儀對(duì)多肽進(jìn)行序列鑒定。

1.3 材料復(fù)合與凍干

將膠凍狀鼠尾膠原移至24孔板中的12孔，其中6孔為單純膠凍狀鼠尾膠原;另6孔首先在各孔底部覆蓋一層鼠尾膠原，然后6孔各10mg BMP2活性多肽置于鼠尾膠原上，接著將剩余部分鼠尾膠原添加至BMP2活性多肽上面，使之形成一個(gè)“夾層”，最后用無(wú)菌針頭將其混勻，整個(gè)過(guò)程在無(wú)菌超凈臺(tái)中進(jìn)行，同時(shí)適當(dāng)將溫度降低，周?chē)胖帽鶋K。操作結(jié)束后將24孔板放入-20°冰箱中預(yù)凍存，最后放入冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)低溫(-55℃)冷凍干燥24 h后消毒備用。

1.4 環(huán)境掃描電鏡觀察

將凍干后的鼠尾膠原支架材料從凍干機(jī)中取出，拍照，然后在環(huán)境掃描電鏡(QUANTA200，F(xiàn)EI公司，荷蘭)低真空模式下觀察鼠尾膠原支架的孔隙結(jié)構(gòu)。

1.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

12只8周齡健康雄性 SD(Sprague-Dawley)大白鼠(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，每只體重約230～250 g，將其隨機(jī)分成 2組，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，約4 mL/kg。麻醉滿意后，常規(guī)消毒鋪巾，每只大白鼠右側(cè)大腿作2 cm的切口，制備股四頭肌肌袋模型，將上述材料適當(dāng)壓縮后分別植入股四頭肌肌袋肌間隙中，逐層縫合傷口。觀察指標(biāo)：①肉眼觀察：肉眼觀察術(shù)后動(dòng)物的一般情況和傷口的愈合情況;②放射學(xué)檢查(X-ray，CT)：術(shù)后3周和6周觀察成骨情況;③術(shù)后6周取出樣本行組織學(xué)觀察，分別作組織學(xué)切片，HE染色，在光鏡下觀察新骨形成情況。

2 結(jié)果

2.1 環(huán)境掃描電鏡觀察鼠尾膠原

鼠尾膠原支架材料凍干后在環(huán)境掃描電鏡低真空模式下觀察，可見(jiàn)凍干后的鼠尾膠原纖維相互鏈接成多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔徑大小在90～160 μm之間(如圖1)，而復(fù)合BMP2活性多肽后膠原網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變。據(jù)國(guó)內(nèi)外的研究表明，膠原支架的最適宜的孔徑大小在50～150μm之間，此大小的孔徑可以為細(xì)胞的浸入、增殖及血管化提供適宜的空間[9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明鼠尾膠原支架孔徑大小與最適宜的孔徑大小基本相吻合。膠原支架孔間相互連通成多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔徑大小基本一致，有利于養(yǎng)料的傳輸和血管化順利的進(jìn)行。

圖1 鼠尾Ⅰ型膠原。(a)為單純鼠尾膠原凍干后照片;(b)復(fù)合 BMP2活性多肽鼠尾膠原凍干后照片;(c)鼠尾膠原凍干后在環(huán)境掃描電鏡低真空模式下觀察所見(jiàn)(160×)Fig.1 Rat rail collagen.(a)pure rat rail collagen after freeze-dried;(b)the BMP2-derived peptide/rat rail collagen complex after freeze-dried;(c)the structure of rat rail collagen after freeze-dried under low-vacuum electron microscopy(magnification，160×)

2.2 動(dòng)物一般情況

術(shù)后給予青霉素抗感染，所有大白鼠活動(dòng)、進(jìn)食正常，傷口I/甲愈合，無(wú)紅腫、滲液等。3周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組植入?yún)^(qū)周?chē)M織質(zhì)地稍硬，6周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組植入?yún)^(qū)硬度明顯增加;而對(duì)照組3周與6周時(shí)，植入?yún)^(qū)周?chē)M織硬度無(wú)明顯變化。所有大白鼠均健康生存直至取材。

2.3 放射學(xué)檢查

2.3.1 X線片觀察：3周時(shí)，對(duì)照組植入材料區(qū)域無(wú)明顯的成骨現(xiàn)象，而實(shí)驗(yàn)組植入材料區(qū)域可見(jiàn)鈣化影形成。6周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組植入材料區(qū)域可見(jiàn)塊狀的明顯鈣化影形成，密度比正常骨形成應(yīng)要低，而對(duì)照組仍無(wú)明顯的成骨現(xiàn)象。(見(jiàn)圖2)。

圖2 放射學(xué)檢查(X線)。(a)實(shí)驗(yàn)組第3周時(shí)X線片可見(jiàn)植入?yún)^(qū)有鈣化影形成;(b)實(shí)驗(yàn)組第6周時(shí)X線片可見(jiàn)植入?yún)^(qū)有明顯的鈣化影形成Fig.2 The radioactivity inspection(X-ray).(a)the experimental group had calcification shade formation by X-ray at the 3rd week;(b)the experimental group had the obvious calcification shade formation around the implants at the 6th week

2.3.2 CT三維成像觀察：對(duì)照組：3周與6周時(shí)該組所有大白鼠植入材料區(qū)域未見(jiàn)明顯的點(diǎn)狀或塊狀高密度影;實(shí)驗(yàn)組：3周時(shí)，可見(jiàn)輕微的點(diǎn)狀或小塊狀高密度影，比正常的骨密度低，6周時(shí)，可見(jiàn)塊狀的高密度影，范圍較3周時(shí)所見(jiàn)大，且骨密度較前觀察時(shí)間點(diǎn)要高(見(jiàn)圖3)。

2.4 組織學(xué)觀察

蘇木素-伊紅染色，大體觀，植入?yún)^(qū)域周?chē)跗诰憩F(xiàn)為急性炎癥反應(yīng)，后期均為淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)為主的非特異性炎癥反應(yīng)。第3周時(shí)，兩組大白鼠植入?yún)^(qū)域周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，可見(jiàn)少量的淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，毛細(xì)血管充血不明顯。實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)植入?yún)^(qū)域周?chē)g充質(zhì)細(xì)胞開(kāi)始向軟骨細(xì)胞分化，分化成熟的軟骨細(xì)胞可見(jiàn)，部分區(qū)域可見(jiàn)軟骨島和成骨細(xì)胞，對(duì)照組植入?yún)^(qū)域除可見(jiàn)炎癥反應(yīng)細(xì)胞外，還可見(jiàn)纖維性囊膜。第6周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組植入?yún)^(qū)域周?chē)梢?jiàn)軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞，并有編織骨和大量新骨形成，在其周?chē)梢?jiàn)到新生血管。對(duì)照組可見(jiàn)巨噬細(xì)胞等分列在植入物與周?chē)M織的界面上，纖維膜性結(jié)構(gòu)增厚，未見(jiàn)軟骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞，其與肌肉組織分界較為清晰(見(jiàn)圖4)。

圖3 放射學(xué)檢查(CT)。(a)實(shí)驗(yàn)組第3周時(shí)薄層CT掃描可見(jiàn)植入?yún)^(qū)有高密度影形成;(b)實(shí)驗(yàn)組第6周時(shí)薄層CT掃描可見(jiàn)植入?yún)^(qū)高密度影范圍較前大Fig.3 The radioactivity inspection(CT).(a)the experimental group had high-density shade formation around the implants by CT at the 3rd week;(b)the experimental group had a bigger high-density shade by CT at the 6th week

3 討論和結(jié)論

鼠尾膠原來(lái)源廣泛，成分單一為Ⅰ型膠原，本身無(wú)毒性，生物相容性好，其降解產(chǎn)物在較短時(shí)間內(nèi)可被機(jī)體吸收;同時(shí)凍干后鼠尾膠原支架的三維空間結(jié)構(gòu)具有一定的強(qiáng)度以及適宜的孔徑，保持了天然的滲透性，對(duì)細(xì)胞因子和細(xì)胞可以起到錨定和支持作用，為細(xì)胞增殖和功能分化提供合適的微環(huán)境，是構(gòu)建組織工程支架的良好原料。鼠尾Ⅰ型膠原是骨組織的主要成分之一，是骨細(xì)胞外基質(zhì)中最豐富的蛋白，其主要功能是作為組織支持物，賦與組織以張力;鼠尾Ⅰ型膠原也是骨組織細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，可為成骨細(xì)胞提供支架，有利于成骨細(xì)胞和血管的遷移、長(zhǎng)入[10]。鼠尾Ⅰ型膠原作為骨組織工程支架可以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的遷移和分化，其結(jié)構(gòu)對(duì)礦物質(zhì)沉積具有誘導(dǎo)作用，它的表面含有促進(jìn)成骨細(xì)胞吸附、礦物質(zhì)沉積的位點(diǎn)，可有效地增強(qiáng)礦化與成骨過(guò)程，使植入?yún)^(qū)肌肉組織生成新骨[11]。因鼠尾Ⅰ型膠原可為成骨細(xì)胞提供支架和促進(jìn)基質(zhì)礦化、鈣鹽沉積，相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明鼠尾膠原凍干后孔隙率高，結(jié)構(gòu)合理，更有利于成骨細(xì)胞的吸附與爬行修復(fù)。在本實(shí)驗(yàn)中鼠尾膠原作為支架材料復(fù)合BMP2活性多肽，植入大白鼠股四頭肌內(nèi)無(wú)免疫排斥反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具有科學(xué)性。

圖4 組織學(xué)(HE染色)，實(shí)驗(yàn)組第6周時(shí)取材HE染色后可見(jiàn)有成骨細(xì)胞、軟骨陷窩和新生骨形成。(a)200×;(b)400×Fig.4 Histological examination(HE). The experimental group had osteoblast and cartilage lacuna and new bone formation around the implants by histology observation(HE)at the 6th week.(a)200×;(b)400×

研究表明，BMPs誘導(dǎo)成骨的作用大致分為4個(gè)階段：趨化期、分化期、骨質(zhì)形成及重塑期。這個(gè)過(guò)程中間充質(zhì)細(xì)胞在局部BMPs的刺激下發(fā)生化學(xué)趨向、聚集、分化形成軟骨和骨，最后形成骨髓[12]。BMP2的主要生物學(xué)特性是刺激未分化的間充質(zhì)細(xì)胞粘附，增值及定向分化，從而誘導(dǎo)新骨的形成。BMP2具有極強(qiáng)的誘導(dǎo)成骨能力[13-14]。雖然天然人BMP2成熟肽由114個(gè)氨基酸組成，但真正發(fā)揮骨誘導(dǎo)作用的只是由20余個(gè)氨基酸組成的核心結(jié)構(gòu)域。本課題組就是根據(jù)BMP2的核心功能區(qū)域的氨基酸序列，用固相法合成BMP2活性多肽P24。其相對(duì)分子質(zhì)量小，空間結(jié)構(gòu)呈線狀，活性位點(diǎn)易于暴露，功能發(fā)揮穩(wěn)定。同時(shí)，P24小分子肽的應(yīng)用，克服了全長(zhǎng)BMP2序列中其它結(jié)構(gòu)域引發(fā)的不必要的生物學(xué)效應(yīng)。BMP2活性多肽是根據(jù)天然 BMP2具有誘導(dǎo)成骨功能的核心功能區(qū)設(shè)計(jì)合成的含24個(gè)氨基酸的寡肽，它包含磷酸化的絲氨酸以及天冬氨酸，能夠極好地模擬天然骨基質(zhì)的促發(fā)及指導(dǎo)礦化的功能，在局部形成偏酸的環(huán)境，促進(jìn)局部的鈣磷沉積、成核和生物自組裝礦化[3，15]。同時(shí)，短鏈多肽活性位點(diǎn)能充分暴露并與細(xì)胞表面受體結(jié)合，生物活性更強(qiáng)，它在與鼠尾膠原材料復(fù)合過(guò)程中穩(wěn)定性更好，復(fù)合后隨著膠原的逐漸降解而釋放，持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)[15]。BMP2活性多肽與 BMP2一樣具有生物學(xué)活性，它作為一種分子誘導(dǎo)信號(hào)，能通過(guò)特定的方式對(duì)細(xì)胞的黏附和向成骨方向定向分化等生物學(xué)行為進(jìn)行精確的調(diào)控，有很好的骨誘導(dǎo)活性[12]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)鼠尾Ⅰ型膠原作為BMP2活性多肽的載體植入大白鼠股四頭肌肌袋后，可觀察到植入?yún)^(qū)周?chē)g質(zhì)細(xì)胞向植入?yún)^(qū)積聚、分化、增生;間質(zhì)細(xì)胞分化為幼稚的軟骨細(xì)胞，并逐漸成熟，繼而分化為成骨細(xì)胞與骨細(xì)胞，基質(zhì)鈣化，有力地證實(shí)了BMP2活性多肽的骨誘導(dǎo)活性與成骨作用，為下一步實(shí)驗(yàn)提供了較好的理論依據(jù)，如果能成功的運(yùn)用于臨床將為骨病患者帶來(lái)福音。

鼠尾Ⅰ型膠原是一種較好的載體支架材料，自行研制合成的BMP2活性多肽與其復(fù)合后，具有較強(qiáng)的異位誘導(dǎo)成骨能力。

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