α-酮戊二酸對脂多糖刺激仔豬血液生化指標、血液激素水平和炎性細胞因子水平的影響

王 蕾 侯永清 丁斌鷹 劉玉蘭 朱惠玲

仔豬斷奶日齡越早，免疫系統(tǒng)功能越低，越易受病原體的感染。當斷奶仔豬在病原體和非病原體等大分子物質(zhì)的刺激下，免疫系統(tǒng)活化，被激活的單核巨嗜細胞系統(tǒng)會釋放出一系列細胞炎性因子（如IL-1、IL-6、TNF-α），這些細胞因子不僅是參與免疫防御的主要活性物質(zhì)，使動物處于免疫應(yīng)激狀態(tài)，而且能通過改變體內(nèi)激素水平或?qū)Π薪M織的直接作用來調(diào)節(jié)免疫應(yīng)激過程中機體內(nèi)養(yǎng)分的代謝[1]，使機體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)從支持生長發(fā)育轉(zhuǎn)向為支持與免疫系統(tǒng)活化有關(guān)的過程。日糧中添加α-酮戊二酸（AKG）能在一定程度上改善斷奶仔豬的生長性能[2]。

本試驗研究AKG對LPS刺激仔豬血液生化指標、血液激素水平和炎性因子水平的影響，旨在探討AKG是否可緩解LPS所導(dǎo)致的應(yīng)激反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

α-酮戊二酸（AKG）：市售獸醫(yī)藥級產(chǎn)品，純度≥99.0%。

脂多糖（LPS）：Sigma公司提供，大腸桿菌血清型O55:B5。

1.2 試驗動物與試驗設(shè)計

選用24頭健康的（24±1）日齡斷奶仔豬[杜×長×大，體重（7.25±0.23）kg]，隨機分成 3 個處理組（空白對照組、應(yīng)激對照組、AKG組），每個處理8個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬。各組基礎(chǔ)日糧一致，空白對照組和應(yīng)激對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，AKG組飼喂基礎(chǔ)日糧+1%AKG。試驗期為16 d。于試驗第10、12、14和16 d清晨，禁食狀態(tài)下，應(yīng)激對照組和AKG組仔豬分別腹膜注射80 μg/kg BW的LPS，空白對照組注射相應(yīng)劑量的滅菌生理鹽水。

1.3 日糧組成

基礎(chǔ)日糧配制參照NRC（1998）豬的營養(yǎng)需要（10～20 kg），基礎(chǔ)日糧的組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成與營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.4 飼養(yǎng)管理

豬舍為全封閉式，屋頂以排氣扇通風(fēng)，試驗期間豬舍保持溫度為22～25℃。試驗豬在代謝籠中飼養(yǎng)，自由采食，乳頭式飲水器飲水，豬舍定時清掃和消毒。

1.5 血漿樣品采集

分別于試驗第10、16 d注射LPS或生理鹽水后3 h，用肝素抗凝真空管從仔豬前腔靜脈采血，靜置15 min后，3 000 r/min離心10 min，取上清液得到血漿，分裝后-80℃保存待測。

1.6 測定指標與方法

1.6.1 血液常規(guī)生化指標

取出冷凍保存的血漿，采用日立7020全自動生化分析儀測定有關(guān)生化指標。測定指標與方法如下。

對水利建設(shè)單位加強管理，杜絕企業(yè)資質(zhì)外借。各級水利部門要對水利建設(shè)企業(yè)進行嚴格管理，定期進行檢查，統(tǒng)計企業(yè)所參與投標項目及其中標情況，同時根據(jù)企業(yè)實力核定其能從事的項目建設(shè)能力，幫助企業(yè)不斷增強自身競爭力，遵守水利建設(shè)市場的規(guī)則規(guī)范。對外借資質(zhì)的企業(yè)，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，必須給予嚴厲處罰，可進行停業(yè)整頓或者禁止其1年內(nèi)參與任何水利工程投標等。

①血漿總蛋白（TP）：雙縮脲法；②血漿白蛋白（ALB）：BCG 比色法；③血漿球蛋白（GLO）：BCG 比色法；④血漿尿素氮（BUN）：酶偶聯(lián)速率法；⑤乳酸脫氫酶（LDH）：連續(xù)監(jiān)測法。

1.6.2 血液激素及炎性細胞因子水平

生長激素（GH）、生長抑素（SS）、白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-α）、表皮生長因子（EGF）采用放射免疫試劑盒（北京華英生物技術(shù)研究所產(chǎn)品）測定。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和Duncan's多重比較，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.1表示具有顯著性趨勢。

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 AKG對LPS刺激仔豬血液生化指標的影響（見表2）

LPS首次應(yīng)激時（第10 d）：①與空白對照組相比，應(yīng)激對照組總蛋白含量顯著下降（P＜0.05），應(yīng)激對照組與AKG組差異不顯著（P＞0.05）。②與空白對照組相比，應(yīng)激對照組球蛋白顯著降低（P＜0.05），和應(yīng)激對照組相比，AKG組血漿球蛋白含量有所升高，但差異不顯著（P＞0.05），同時，和空白對照組相比，AKG組差異也不顯著（P＞0.05），介于兩者之間。說明AKG在一定程度上緩解了血漿球蛋白含量的下降。③與空白對照組相比，應(yīng)激對照組ALB/GLO 顯著降低（P＜0.05），AKG 組沒有差異（P＞0.05）；與應(yīng)激對照組相比，AKG組ALB/GLO顯著提高（P＜0.05）。

表2 AKG對LPS刺激仔豬血液生化指標的影響

仔豬經(jīng)4次LPS刺激后（第16 d）：與空白對照組相比，應(yīng)激對照組球蛋白顯著升高（P＜0.05）、ALB/GLO顯著降低（P＜0.05）；和應(yīng)激對照組相比，AKG組球蛋白顯著降低（P＜0.05），ALB/GLO 有所升高，但差異不顯著（P＞0.05），同時，和空白對照組相比，AKG組ALB/GLO差異也不顯著（P＞0.05），介于兩者之間。

2.2 AKG對LPS刺激仔豬血液激素及炎性細胞因子水平的影響（見表3）

表3 AKG對LPS刺激仔豬血液激素及炎性細胞因子水平的影響

仔豬經(jīng)4次LPS刺激后（第16 d）：與空白對照組相比，應(yīng)激對照組EGF顯著降低（P＜0.001），與應(yīng)激對照組相比，AKG組EGF顯著升高（P＜0.001）。

3 討論

在LPS應(yīng)激狀況下，腸屏障受損，大量細菌和毒素經(jīng)門靜脈和腸系膜淋巴系統(tǒng)進入體循環(huán)，導(dǎo)致腸源性內(nèi)毒素血癥和細菌移位，并可引發(fā)炎癥連鎖反應(yīng)，引起全身炎癥反應(yīng)綜合征，出現(xiàn)如厭食、嗜睡和發(fā)熱等癥狀。LPS通過刺激巨噬細胞（Mφ）合成和分泌白細胞介素（IL）-1、IL-6和 TNF（腫瘤壞死因子）-α 等炎性細胞因子發(fā)揮作用[3]。

3.1 AKG對LPS刺激仔豬血液生化指標的影響

血液生化指標的改變是組織細胞通透性發(fā)生改變和機體新陳代謝機能發(fā)生改變的反映。

仔豬血漿白蛋白由肝臟合成，是機體蛋白質(zhì)的一個來源，可用于修補組織和提供能量。血漿球蛋白則是源于B細胞轉(zhuǎn)化為漿細胞后分泌而成，能反映機體的抵抗力，總蛋白則是前兩者之和?？偟鞍自谝欢ǔ潭壬洗砹巳占Z中蛋白質(zhì)的營養(yǎng)水平及動物對蛋白質(zhì)的消化吸收程度。正常狀態(tài)下的仔豬這3個指標維持在適度高水平可增強抵抗應(yīng)激的能力而不影響生長性能。這三個指標降低通常是動物發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)的標志之一，如雞熱應(yīng)激的情況下，上述三個指標均顯著下降[4]。

本試驗結(jié)果表明，仔豬LPS刺激后，應(yīng)激對照組血漿球蛋白先顯著降低多次刺激后又顯著升高。這說明LPS刺激對仔豬造成很大的應(yīng)激。當仔豬在受到外界各種抗原（尤以日糧抗原與微生物抗原為主）的刺激，會激發(fā)免疫反應(yīng)，短時間內(nèi)會產(chǎn)生較高水平的抗體（球蛋白）用于抵制抗原；然而長時間的合成、分泌抗體必然會使日糧中用于生長的營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)向了免疫系統(tǒng)的合成來支持免疫反應(yīng)，從而影響生長速度，甚至出現(xiàn)病態(tài)反應(yīng)。日糧中添加1%AKG后仔豬血漿中球蛋白水平保持不變（AKG組和空白對照組相比差異不顯著），這說明添加AKG能在一定程度上改善LPS導(dǎo)致的應(yīng)激反應(yīng)，提高仔豬機體的免疫功能。這與夏利寧（2004）[5]的研究結(jié)果相似。這可能是外源性AKG能作為腸道的能源物質(zhì)，維持腸道屏障功能，減少細菌易位，促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收，可較好地保證血液中的抗體正常適度的合成和分泌，從而緩解了應(yīng)激。

3.2 AKG對LPS刺激仔豬血液激素及炎性細胞因子水平的影響

生長激素（GH）是腦垂體前葉分泌的一種激素，是調(diào)控生長的核心，GH能促進生長，可促進蛋白質(zhì)合成，且能調(diào)節(jié)體內(nèi)的物質(zhì)代謝，主要通過抑制肌肉及脂肪組織利用葡萄糖，同時促進肝臟中的糖異生作用及對糖元進行分解，從而使血糖升高。GH可促進脂肪分解，使血漿游離脂肪酸升高，使能量來源由糖代謝轉(zhuǎn)向脂肪代謝。GH主要受下丘腦分泌的生長激素釋放因子（GRF）和生長抑素（SS）的雙向調(diào)節(jié)，其中SS是抑制垂體GH分泌的主要下丘腦激素，有資料表明，SS抑制GH的基礎(chǔ)分泌，但只有在應(yīng)激導(dǎo)致GH分泌過多時才顯著發(fā)揮抑制作用[6]。SS的抑制作用最終表現(xiàn)為使機體代謝降低，動物生長受到一定程度抑制。本試驗結(jié)果表明，LPS刺激后，各試驗組血漿中GH和SS含量差異不顯著（P＞0.05），顯示AKG對GH和SS的分泌可能沒有影響。AKG能有效緩解LPS刺激對杜長大斷奶仔豬血液IGF-Ⅰ和胰島素水平下降[2]。

表皮生長因子（EGF）廣泛存在于體內(nèi)眾多組織中，尤以胃腸道為甚[7]，能刺激上皮生長。本試驗首次發(fā)現(xiàn)AKG可以促進EGF的分泌（見表3）。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激可使血漿EGF含量降低，而日糧中添加1%AKG能顯著緩解這種變化。EGF對維持胃腸道結(jié)構(gòu)和功能的完整等方面具有重要作用，原因是EGF能促進腸道黏膜上皮細胞的增殖和分化，增強黏膜對養(yǎng)分的利用，減輕多種因素對胃腸道形態(tài)的損害。EGF對腸黏膜屏障的保護可能與其調(diào)節(jié)谷胺酰胺（Gln）的轉(zhuǎn)運和小腸對谷氨酰胺的攝取和利用有關(guān)。EGF可明顯促進谷胺酰胺的作用，使其發(fā)揮最大效用，并可持續(xù)刺激小腸蛋白合成[7]。TGF-α（轉(zhuǎn)化生長因子-α）為EGF的同源物，也作用于EGF受體，是另一種胃上皮生長的調(diào)控因子。本試驗研究表明，LPS和AKG對血漿中的TGF-α含量沒有影響（P＞0.05）。

LPS通過作用于機體內(nèi)的單核巨噬細胞，誘導(dǎo)該細胞合成和分泌多種介質(zhì)分子，并借助這些介質(zhì)分子在局部發(fā)揮作用，或隨血液播散至機體其他部分而發(fā)揮作用。

IL-6和TNF-α是免疫細胞產(chǎn)生和釋放出來的主要炎性細胞因子。TNF-α主要由單核巨噬細胞產(chǎn)生，而幾乎所有器官中均有單核細胞存在。TNF-α不僅能介導(dǎo)LPS的多種生物學(xué)效應(yīng)，而且通過誘導(dǎo)其它炎癥介質(zhì)的協(xié)同作用，擴大其生物學(xué)效應(yīng)，從不同環(huán)節(jié)在體內(nèi)產(chǎn)生炎性反應(yīng)和組織損傷。許多研究結(jié)果證實，機體在受到LPS刺激后，體內(nèi)TNF-α含量升高，這與本試驗結(jié)果一致。本試驗表明，與空白對照組和AKG組相比，LPS應(yīng)激可使TNF-α含量顯著升高，1%AKG可以有效抑制LPS刺激導(dǎo)致的血漿TNF-α含量上升。IL-6是一種具有多種生物學(xué)活性的細胞因子，主要由活化的T細胞產(chǎn)生和巨噬細胞產(chǎn)生[8]。IL-6在急性期反應(yīng)中刺激肝細胞蛋白質(zhì)合成，是一種內(nèi)源性致熱源，IL-6感染和組織損傷有關(guān)。因此，在感染和組織損傷中IL-6可作為一個預(yù)警指標。與Li等（2006）[9]研究結(jié)果相似，本試驗發(fā)現(xiàn)，LPS應(yīng)激可使血漿中IL-6水平升高，這可能是LPS刺激使機體免疫反應(yīng)過度所致。1%AKG可以在一定程度上降低LPS刺激導(dǎo)致的血漿IL-6水平升高。AKG通過有效地促進氨的代謝機制，同時可轉(zhuǎn)化成谷氨酸家族氨基酸（如合成Gln），從而減輕動物生產(chǎn)過程中的代謝應(yīng)激，在一定程度上緩解LPS刺激導(dǎo)致的仔豬炎癥反應(yīng)。

4 小結(jié)

LPS刺激導(dǎo)致仔豬產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，而AKG在一定程度上緩解了LPS刺激導(dǎo)致的應(yīng)激反應(yīng)。

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