高效液相色譜-示差折光法測定天然甜菜堿含量

商 軍 王 蓓

甜菜堿又名甘氨酸三甲基內(nèi)鹽（三甲基甘氨酸）或三甲胺乙內(nèi)酯，是一種廣泛存在于動物、植物和微生物中的天然化合物，因最初從甜菜中提取而得名。20世紀(jì)70年代初，芬蘭首次發(fā)現(xiàn)甜菜堿是動物體代謝中間產(chǎn)物，具有提供甲基、調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透壓、促進脂肪代謝和蛋白質(zhì)合成等作用，應(yīng)用于飼料中能明顯改善生產(chǎn)效果，促進動物生長，提高抗應(yīng)激能力，提高抗球蟲療效等（梁冬生等，1997；唐凌，2003；張銳利等，2005）。目前市場上，除天然提純的甜菜堿外，還有化學(xué)合成甜菜堿(純品、粗品或鹽酸鹽)，而天然甜菜堿的純品是通過對甜菜糖蜜的過濾、色譜分離、濃縮和結(jié)晶等四個主要加工步驟完成，成品含量大于96%，是安全性高、天然的飼料添加劑。因此，如何準(zhǔn)確快速測定該產(chǎn)品中甜菜堿含量就非常重要。目前飼料工業(yè)中，天然甜菜堿含量的測定方法為GB/T 2515—2008《飼料添加劑天然甜菜堿》中的離子色譜法和高氯酸滴定法，該標(biāo)準(zhǔn)中離子色譜法雖專屬性較強，但實驗操作條件控制要求較高；高氯酸滴定法的專屬性及測定結(jié)果的準(zhǔn)確性均較差。為此，用更為快速簡便、適用性更強的示差折光-高效液相色譜法測定天然甜菜堿含量，經(jīng)試驗研究表明，結(jié)果令人滿意，適用于飼料添加劑天然甜菜堿含量測定。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

高效液相色譜系統(tǒng)（包括：2414型示差折光檢測器；柱溫箱；515泵；Empower色譜工作處理站，WatersTM公司）；超聲波清洗器（KQ-250DB型，昆山市超聲波儀器有限公司）；硫酸鈉（A.R.，上海試劑公司）；甜菜堿對照品（99.7%，中國藥品生物制品檢定所）；水（去離子水，符合GB/T6682一級用水的規(guī)定）。天然甜菜堿試樣（A 廠，批號：G5129、G 5132、G5137；B廠，批號：UT09070406、UT09070515、UT09070528）；合成甜菜堿（市場抽檢，C廠，批號：0901126）。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液制備

1.2.1.1 對照品溶液制備

稱取在（120±2）℃ 烘干12 h的甜菜堿對照品約0.25 g（精確至0.000 2 g），置于50 ml棕色容量瓶中，加水適量，置超聲波清洗器中助溶，至完全溶解，冷卻至室溫，用水稀釋至刻度，搖勻；經(jīng)0.45 μm無機濾膜濾過，濾液作為對照品溶液。

1.2.1.2 試樣溶液制備

稱取預(yù)先在105℃烘箱干燥至恒重的試樣約0.25 g（精確至0.000 2 g），置于50 ml棕色容量瓶中，加水適量，置超聲波清洗器中助溶，至完全溶解，冷卻至室溫，用水稀釋至刻度，搖勻；經(jīng)0.45 μm無機濾膜濾過，濾液作為試樣溶液。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：陽離子交換柱（Na+形式，長 300 mm，內(nèi)徑 7.8 mm）；流動相：1 mmol/l硫酸鈉溶液（稱取約0.142 g的硫酸鈉，置于1 000 ml容量瓶中，加水適量至完全溶解，并定容至刻度，搖勻，通過0.45 μm無機濾膜過濾脫氣，即得）；流速：0.6 ml/min；柱溫：75 ℃；檢測器內(nèi)控溫度：40℃；進樣量：20 μl。在上述色譜條件下，空白、甜菜堿對照品溶液（5mg/ml）、甜菜堿試樣溶液（5mg/ml）進行色譜系統(tǒng)適用性試驗，數(shù)據(jù)見表1，典型色譜圖見圖1。理論塔板數(shù)按甜菜堿計不低于1 500，保留時間約為13 min。

表1 系統(tǒng)適用性試驗結(jié)果（n=5）

圖1 甜菜堿的HPLC色譜

1.2.3 試樣測定

分別取對照品溶液和試樣溶液，按1.2.2節(jié)色譜條件操作，分別注入液相色譜儀，得對照品和試樣溶液中甜菜堿的峰面積，按外標(biāo)法計算試樣中甜菜堿含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

比較了幾種流動相，分別為水，0.5、1、2 mmol/l硫酸鈉溶液；在0.2～1.0 ml/min范圍內(nèi)改變流動相流速；在50～85℃范圍內(nèi)改變柱溫，甜菜堿對照品溶液（5mg/ml）和甜菜堿試樣溶液（5mg/ml）進樣量為20 μl，對色譜條件進行優(yōu)化，結(jié)果見表1、圖 1。試驗結(jié)果表明，當(dāng)流動相為1 mmol/l硫酸鈉溶液，流速為0.6 ml/min，柱溫為75℃時，色譜系統(tǒng)適用性的測定結(jié)果令人滿意。

2.2 線性關(guān)系

稱取在（120±2）℃烘干12 h的甜菜堿對照品適量（精確至0.000 2 g），加水制成50.13mg/ml的溶液作為貯備液，分別精密量取 1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 ml至25 ml棕色容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。取20 μl注入液相色譜儀，按1.2.2節(jié)的色譜條件操作，記錄色譜峰面積，以對照品溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2、圖2。試驗結(jié)果表明，在2.005～10.026mg/ml濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

表2 甜菜堿線性關(guān)系(n=4)

圖2 甜菜堿對照品溶液濃度與峰面積的線性關(guān)系

2.3 精密度試驗

分別取2.2節(jié)的甜菜堿對照品溶液（6.016mg/ml）1份，按1.2.2節(jié)的色譜條件重復(fù)進樣5次，檢驗試驗方法的重復(fù)性；取G5129一批試樣制備成試樣溶液5份，按1.2.2節(jié)的色譜條件進樣，檢驗試樣測定重復(fù)性，結(jié)果見表3。試驗結(jié)果表明，甜菜堿對照品峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.06%，保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.09%；5份甜菜堿試樣峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.85%，系統(tǒng)和樣品測定重復(fù)性均較好。

表3 方法的精密度試驗結(jié)果

2.4 穩(wěn)定性試驗

取 G5129 一批的試樣溶液，分別于 0、2、4、6、8、10、24、30、36、48 h 進樣 20 μl，在 0～24 h，測得峰面積的RSD為0.97%；在30 h后峰面積顯著下降，說明試樣有部分分解。試驗結(jié)果表明，試樣溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 回收率試驗

依次稱取預(yù)先在105℃烘箱干燥至恒重的已知含量的甜菜堿試樣（97.6%）約 0.4、0.5、0.6 g各三份（精確至 0.000 2 g），置于 100 ml棕色容量瓶中，按1.2.1.2節(jié)的試樣溶液制備操作，制備成試樣溶液；另取甜菜堿對照品，按1.2.1.1節(jié)的對照品溶液制備操作，制備成對照品溶液。分別取20 μl注入液相色譜儀，按1.2.2節(jié)的色譜條件操作，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計算測定結(jié)果，結(jié)果見表4。試驗結(jié)果表明，試樣不同量的甜菜堿平均回收率為98.8%，RSD為0.41%，方法的準(zhǔn)確度較好。

表4 回收率試驗測定結(jié)果

2.6 不同方法的試樣測定比較

分別取甜菜堿對照品及不同來源試樣各0.25 g，按1.2.1節(jié)的溶液制備，分別制備成對照品溶液和試樣溶液，按1.2.2節(jié)的色譜條件操作，分別注入液相色譜儀，得對照品和試樣溶液中甜菜堿的峰面積，按外標(biāo)法分別計算試樣中甜菜堿含量。同時按GB/T 21515—2008中離子色譜法和高氯酸滴定法測定同批試樣中的甜菜堿含量，結(jié)果見表5。試驗結(jié)果表明，與離子色譜法相比，本法與離子色譜法測定天然及合成甜菜堿的結(jié)果均無顯著差異，但本法精密度較好；高氯酸滴定法測定的結(jié)果均較本法與離子色譜法的要高，且該法的專屬性及測定結(jié)果的準(zhǔn)確性均較差，不能準(zhǔn)確區(qū)別天然甜菜堿與合成甜菜堿。

3 結(jié)論

以上試驗結(jié)果表明，本法操作簡便易行，色譜系統(tǒng)適用性良好，方法的準(zhǔn)確性、重復(fù)性均較好，可用于飼料添加劑天然甜菜堿含量的質(zhì)量控制。

表5 不同方法測定試樣含量的結(jié)果比較（n=3，%）

[1]梁冬生，蘇曉鷗，陳益眾.甜菜堿[J].飼料工業(yè)，1997，18(3)：34-37.

[2]唐凌.甜菜堿在畜禽飼料中的應(yīng)用研究[J].中國飼料，2003(13)：13-15.

[3]張銳利，張立武.甜菜堿及其營養(yǎng)功能[J].中國食物與營養(yǎng)，2005(2)：23-24.

[4]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB/T 21515—2008 飼料添加劑 天然甜菜堿[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.