香蕉莖葉中乳酸菌的分離和鑒定

徐紹成 楊 瑞 楊勁松

乳酸菌是指一群通過(guò)發(fā)酵糖類(lèi)生產(chǎn)大量乳酸的細(xì)菌的總稱(chēng)，是革蘭氏陽(yáng)性菌、不形成芽孢(個(gè)別屬除外)、不進(jìn)行呼吸的球菌或桿菌，在發(fā)酵碳水化合物時(shí)主要的代謝產(chǎn)物為乳酸[1]。乳酸菌是促進(jìn)青貯料發(fā)酵酸化成熟的有益菌群，為降低青貯損失，提高青貯品質(zhì)，許多國(guó)家正研究使用乳酸菌添加劑。大量研究結(jié)果表明，乳酸菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、抑制腸道致病菌定植、提高機(jī)體免疫力、改善機(jī)體營(yíng)養(yǎng)狀況等作用，因而在多個(gè)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[2]。乳酸菌在自然界分布廣泛，人、畜、禽腸道、許多食品、物料及少數(shù)臨床樣品中均有存在。本試驗(yàn)對(duì)自然界中的香蕉莖葉表面附著的乳酸菌進(jìn)行分離,并對(duì)分離菌株性能進(jìn)行了初步研究，從中篩選出性狀優(yōu)良的乳酸菌，為制備優(yōu)良的青貯飼料專(zhuān)用發(fā)酵劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

樣品來(lái)源：從海南省中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院基地中采集樣品。

培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基，鑒定用培養(yǎng)基[3]。

主要設(shè)備：超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、PHS-2C精密酸度計(jì)、厭氧裝置、顯微鏡。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備

將采來(lái)的香蕉莖葉切碎，用四分法均勻稱(chēng)取10 g樣品于90 ml無(wú)菌生理鹽水中，振蕩均勻，靜置2 h，用移液管吸取1 ml，加入到裝有9 ml無(wú)菌生理鹽水的試管中，逐次稀釋至 10-5，選擇 10-3、10-4、10-5三個(gè)稀釋度。

1.2.2 菌株的分離

分別取這3種稀釋液0.1 ml，采用涂布法，用含10%CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基進(jìn)行分離，經(jīng)37℃恒溫厭氧培養(yǎng)48 h。挑取典型菌落，仔細(xì)觀(guān)察菌落形態(tài)，同時(shí)進(jìn)行革蘭氏染色、油鏡下觀(guān)察菌體形態(tài)和接觸酶試驗(yàn)。

1.2.3 乳酸菌屬的鑒定試驗(yàn)

根據(jù) R.E Buchanan（1984）、楊潔冰（1996）[4-5]介紹，凡是革蘭氏陽(yáng)性，過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陰性，在MRS培養(yǎng)基上菌落周?chē)纬擅黠@的透明環(huán)的所有分離菌，均初步定為乳酸菌。在確定為乳酸菌的前提下，進(jìn)一步進(jìn)行明膠液化試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、H2S產(chǎn)生試驗(yàn)、pH值4.5生長(zhǎng)試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)等來(lái)確定屬的劃分。

1.2.4 乳酸菌種的鑒定試驗(yàn)

根據(jù)凌代之等（1999）[6]介紹，乳酸菌種的鑒定主要是根據(jù)供試菌株對(duì)碳水化合物的發(fā)酵產(chǎn)酸試驗(yàn)，即通過(guò)對(duì)單糖、二糖、三糖、多糖以及糖苷和糖醇類(lèi)等碳水化合物的利用情況來(lái)區(qū)分。

1.2.5 用于制作青貯飼料發(fā)酵劑的優(yōu)良乳酸菌篩選試驗(yàn)

將分離并鑒定的3株乳酸菌分別按3%的接種量傳入MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)。每隔2 h測(cè)定不同菌株發(fā)酵液pH值，繪制的產(chǎn)酸速率曲線(xiàn)是不同發(fā)酵時(shí)間(h)所對(duì)應(yīng)發(fā)酵液pH值的變化[7]。根據(jù)不同菌株的產(chǎn)酸能力以及產(chǎn)酸速率來(lái)篩選適宜用作青貯飼料的菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)厭氧培養(yǎng)48 h后，觀(guān)察菌落的形態(tài)和特征，分別挑取典型菌落且周?chē)刑妓徕}透明圈的單菌落共5 株，分別命名為 HN1、HN2、HN3、HN4、HN5，革蘭氏染色、菌落特征及細(xì)胞形態(tài)、大小、排列方式鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

從表1可以看出，從香蕉莖葉中分離的5株菌種中，HN4和HN5為G-，不符合乳酸菌特性。其余3株均為G+，菌落光滑、濕潤(rùn)，符合乳酸菌特性。對(duì)菌體形態(tài)和排列方式的觀(guān)察可知，HN1菌株具有植物乳酸桿菌的形態(tài)學(xué)特征，HN2菌株具有短乳桿菌的形態(tài)特征，HN3具有乳酸片球菌的形態(tài)特征。

表1 5株菌的形態(tài)特征

2.2 乳酸菌的鑒定

2.2.1 桿菌HN1、HN2屬種鑒定的結(jié)果

對(duì)初步篩選到的兩株桿菌進(jìn)行了進(jìn)一步的試驗(yàn)鑒定，結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

從表2、表3可見(jiàn)，所有菌種都能水解淀粉，KOH試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)均為陰性，但對(duì)多種糖的利用情況不同。綜合乳酸菌分類(lèi)鑒定的文獻(xiàn)資料，可將HN1株菌種初步確定為植物乳桿菌，HN2菌株確定為短乳桿菌。

表2 HN1、HN2生化試驗(yàn)結(jié)果

表3 HN1、HN2碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 球菌HN3屬種鑒定結(jié)果（見(jiàn)表4）

由表4可知，HN3不運(yùn)動(dòng)，不產(chǎn)生吲哚，不還原硝酸鹽，發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣等，符合片球菌屬的特征。在對(duì)各種碳水化合物的發(fā)酵試驗(yàn)中,HN3能利用木糖、海藻糖和核糖，因此，可初步判定HN3為乳酸片球菌。

表4 HN3菌株生理生化特征及糖發(fā)酵試驗(yàn)

2.3 產(chǎn)酸速率測(cè)定結(jié)果（見(jiàn)圖1）

圖1 不同菌株的產(chǎn)酸速率

如圖1所示，在接入3%的接種量后，3株分別很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在前12 h，代謝速度都在加快，產(chǎn)酸量明顯增加，pH值很快下降；在12～18 h的穩(wěn)定期中，菌體產(chǎn)酸量明顯減少，18 h后，產(chǎn)酸量幾乎不再增加，pH值趨于穩(wěn)定。其中植物乳桿菌HN1和短乳桿菌HN2兩株菌株的產(chǎn)酸性能較好，HN1菌株的產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，18 h左右pH值就能達(dá)到3.2，而HN2菌株在18 h后也能達(dá)到3.6。球菌HN3的產(chǎn)酸速率比較差。產(chǎn)酸速度是乳酸菌活力良好的重要特征之一，不同菌株間存在較大的差異。在青貯飼料制備過(guò)程中pH值的快速并且大幅度的降低能夠顯著抑制青貯玉米原料中的那些對(duì)青貯飼料品質(zhì)有不良影響的微生物，如丁酸菌、絲狀真菌、酵母及霉菌的生長(zhǎng)，從而提高青貯飼料的品質(zhì)。因此，植物乳桿菌HN1和短乳桿菌HN2可被用來(lái)制作優(yōu)良的香蕉青貯發(fā)酵劑。

3 討論及結(jié)語(yǔ)

本試驗(yàn)從海南熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院采集的香蕉莖葉樣品中分離到3株乳酸菌，首先用傳統(tǒng)的生理生化性質(zhì)測(cè)定方法進(jìn)行初步的種屬鑒定，其中一株為植物乳桿菌，一株為短乳桿菌，還有一株為乳酸片球菌。

通過(guò)本試驗(yàn)分離到的3株乳酸菌產(chǎn)酸能力測(cè)定結(jié)果表明，HN1和HN2株菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期較長(zhǎng)，產(chǎn)酸性能較高，分別達(dá)到了3.2和3.6，而片球菌HN3產(chǎn)酸能力較差，這符合Nancy J.Gardner等（2001）片球菌在產(chǎn)酸能力上確實(shí)稍差于乳桿菌的試驗(yàn)結(jié)果[8]。本試驗(yàn)所分離菌株具有適應(yīng)期短，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期長(zhǎng)，菌液pH值下降較快，產(chǎn)酸性能較高的特點(diǎn)；同時(shí)，具有耐高溫，耐干旱等海南熱帶特色特點(diǎn)，上述特點(diǎn)表明，HN1和HN2菌株適合開(kāi)發(fā)作為香蕉莖葉青貯飼料微生態(tài)制劑。

[1]朱丹宇,王英,周劍忠,等.酸馬奶中乳酸菌的分離和鑒定[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2009(1):245－246.

[2]劉文華,任慧英,鄒玲,等.一株優(yōu)良乳酸菌的分離鑒定與特性研究[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2008,35(2):153－153.

[3]Jeppesen V F,Huss H H.Characteristics and Antagonistic Activity of Lactic Acid Bacteria Isolated from Chilled Fish Products[J].International Journal of Food Microbiology,1993,18:305－320.

[4]R.E Buchanan.伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)(第八版)[M].北京:科學(xué)出版社,1984：702－810.

[5]楊潔冰.乳酸菌生物學(xué)基礎(chǔ)及應(yīng)用[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,1996：7－30.

[6]凌代之,東秀珠.乳酸細(xì)菌分類(lèi)鑒定及實(shí)驗(yàn)方法[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1999.

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[8]N J Gardner,T Savarda,P O bem eierb,et al Selection and characterization of mixed starter cultures for lactic acid fem entation of carrot cabbage,beet and onion vegetable mixtures[J].International Joumal of Food Microbiology,2001,64(3):261－275.