鹽脅迫對二倍體馬鈴薯葉超微結構的影響

張景云，白雅梅，于 萌，李文霞，呂文河*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，哈爾濱 150030）

馬鈴薯作為世界上主要糧食作物之一，其產(chǎn)量僅排在小麥、玉米和水稻之后，占第四位。由于馬鈴薯是對鹽比較敏感的一種作物[1]，所以鹽脅迫嚴重影響了馬鈴薯的生長發(fā)育，進而影響了馬鈴薯的生產(chǎn)。國內(nèi)許多研究者在馬鈴薯耐鹽性[1-4]、馬鈴薯脫毒苗生物產(chǎn)量及VC含量的變化[5]、耐鹽相關生理指標的變化[6]及國外許多研究者在馬鈴薯耐鹽方面做了較多的研究[7-10]，但從未見過有關鹽脅迫對二倍體馬鈴薯細胞超微結構影響的報道。由于二倍體馬鈴薯中具有大量的抗性基因及優(yōu)良品質性狀基因[11-13]，因此從細胞水平上研究二倍體馬鈴薯的耐鹽性具有非常重要的意義。本試驗選取經(jīng)12次輪回選擇適應長日照的富利亞（Solanum phureja，PHU）與窄刀薯（S.stenotomum，STN）雜種（PHUSTN）無性系試管苗為材料，研究耐鹽無性系和鹽敏感無性系受鹽脅迫后細胞超微結構上的差異，尋找耐鹽性鑒定的指標，為篩選和培育馬鈴薯耐鹽品種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究對45份二倍體馬鈴薯（PHU-STN）無性系試管苗進行了耐鹽性篩選，篩選出耐鹽和鹽敏感的無性系，選取了其中耐鹽性較強的無性系BD54-8和耐鹽性較弱的無性系BD57-3為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 基礎苗培養(yǎng)

2009年11月培養(yǎng)基礎苗，取馬鈴薯脫毒試管苗，將其切成帶1片葉的小莖段，插入裝有MS培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，將其置于溫度（25±2）℃，光照2 000～3 000 lx，每日光照16 h的條件下培養(yǎng)。

1.2.2 試驗設計

培養(yǎng)基的配制：配制含有NaCl濃度為0、30 mmol·L-1的 MS培養(yǎng)基，pH 5.8，121℃滅菌 15 min。

材料的培養(yǎng)：取20 d苗齡的試管苗，單一節(jié)莖段培養(yǎng)，取中間莖段，長約1 cm，帶有一個葉，每瓶插10個莖段，20 d后取材固定。

1.2.3 電鏡樣品的制備與觀察

將所取葉片切成1 mm×3 mm的長方形，放入2.5%、pH 6.7的戊二醛中，于4℃固定24 h以上→pH 7.2磷酸緩沖液沖洗3次→2%四氧化餓固定1.5 h→pH 7.2磷酸緩沖液沖洗3次→酒精逐級脫水→100%乙醇與丙酮置換→環(huán)氧樹脂812滲透、包埋→置于恒溫箱內(nèi)聚合→ULPRACUT-EXINXIN型超薄切片機切片→醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛溶液25℃染色，H-7650型透射電子顯微鏡觀察、拍照。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫下細胞膜的變化

正常情況下被測的兩個無性系的細胞膜清晰可見（見圖1A、3A）。鹽分脅迫下，BD57-3（見圖4A）膜的結構被破壞，細胞膜部分向內(nèi)波折折疊，而耐鹽無性系BD54-8（見圖2B）的細胞膜沒有出現(xiàn)這種現(xiàn)象，說明鹽敏感無性系BD57-3的細胞膜破壞比較嚴重。

2.2 鹽脅迫下葉綠體結構的變化

耐鹽無性系BD54-8和鹽敏感無性系BD57-3在未經(jīng)NaCl脅迫時，葉綠體具有雙層膜，類囊體腔小且扁平，葉綠體緊貼在細胞邊緣，呈長橢圓形，結構規(guī)則?；ｉg有基質片層相連，片層排列緊密（見圖1B、圖3B）。

耐鹽無性系BD54-8在30 mmol·L-1NaCl脅迫20 d后，葉綠體外形仍為長橢圓形，葉綠體中的基粒片質和基質片層幾乎沒有受到影響，片層扭曲不明顯，葉綠體有空化的現(xiàn)象（見圖2A）。

鹽敏感無性系BD57-3在30 mmol·L-1NaCl脅迫20 d后，葉綠體結構受到了損傷，幾乎縮成球形，邊緣膜模糊，內(nèi)部出現(xiàn)大而多的空化現(xiàn)象（見圖4A），片層結構扭曲嚴重，基粒的類囊體片層數(shù)減少或解體，只能見到一些松散的片層結構（見圖4B）。

2.3 鹽脅迫下線粒體結構的變化

耐鹽無性系BD54-8和鹽敏感無性系BD57-3在未經(jīng)NaCl脅迫時，線粒體的內(nèi)、外膜及嵴清晰可見，圍繞在葉綠體周圍（見圖1A、圖3A）。

耐鹽無性系BD54-8在NaCl脅迫20 d后，線粒體的內(nèi)、外膜及嵴仍清晰可見，嵴部分模糊不清（見圖2A、圖2B）。

鹽敏感無性系BD57-3在30 mmol·L-1NaCl脅迫20 d后，其線粒體內(nèi)、外膜膨脹，難以辨認出內(nèi)、外膜之間的界限。線粒體基質有些著色深，有些不著色，線粒體嵴均減少或者不明顯，且發(fā)育較差（見圖4A）。

圖1 耐鹽無性系BD54-8未經(jīng)鹽脅迫時質膜、葉綠體、基粒、線粒體的結構Fig.1 Ultrastructure of plasma membrane,chloroplast,granum and mitochondria of the salt tolerant clone BD54-8 without salt stress

圖2 耐鹽無性系BD54-8經(jīng)30 mmol·L-1NaCl鹽脅迫后質膜、葉綠體、基粒、線粒體的結構Fig.2 Ultrastructure of plasma membrane,chloroplast,granum and mitochondria of the salt tolerant clone BD54-8 with stressed at 30 mmol·L-1NaCl

圖3 鹽敏感無性系BD57-3未經(jīng)鹽脅迫時質膜、葉綠體、基粒、線粒體的結構Fig.3 Ultrastructure of plasma membrane,chloroplast,granum and mitochondria of the salt sensitive clone BD57-3 without salt stress

圖4 鹽敏感無性系BD57-3經(jīng)30 mmol·L-1NaCl鹽脅迫后的質膜、葉綠體、基粒、線粒體的結構Fig.4 Ultrastructure of plasma membrane,chloroplast,granum and mitochondria of the salt sensitive clone BD57-3 with stressed at 30 mmol·L-1NaCl

3 討論與結論

鹽脅迫下植物細胞膜系統(tǒng)受到破壞，特別是將引起葉綠體、線粒體超微結構發(fā)生不同程度的變化[14]。鹽脅迫引起細胞器和膜結構破壞，其破壞程度決定了植物耐鹽性的強弱，也是植物受到鹽害的一個重要特征。耐鹽性強的材料，細胞膜系統(tǒng)及細胞器的穩(wěn)定性高，受到的破壞程度小。本試驗結果表明，耐鹽性強的無性系BD54-8細胞膜破壞程度小于鹽敏感無性系BD57-3，這與劉愛峰等對大麥的研究結果相一致[15]，由于耐鹽材料的細胞膜比較穩(wěn)定，能夠抵御鹽脅迫對細胞結構的破壞，對鹽脅迫表現(xiàn)出一定的忍耐力；鹽敏感材料的細胞膜容易被破壞，從而功能喪失。葉綠體是感受鹽脅迫最敏感的細胞器，正常情況下，葉綠體的內(nèi)、外兩層膜清晰可見，類囊體平行排列，基粒和基質片層排列規(guī)則有序。鹽脅迫后，膜變得模糊，類囊體腫脹膨大，基粒和基質片層模糊。有學者對甘薯、馬鈴薯在鹽脅迫下葉綠體的變化做了研究[10,16]。Smith等對不同耐鹽生態(tài)型的匍莖翦股穎（Agrostis stolonifera）做了研究[17]，結果表明，不同耐鹽生態(tài)型對NaCl的反應各不相同，鹽脅迫破壞了鹽敏感型細胞的線粒體結構，嵴的數(shù)目減少，線粒體膨脹，而耐鹽生態(tài)型結構仍正常；水分脅迫下的玉米、鹽脅迫下的小麥耐鹽系愈傷組織和疫霉根腐病菌毒素對大豆根部的線粒體也表現(xiàn)出上述類似的結果[18-20]。因此，鹽分脅迫對線粒體超微結構的影響，通常因植物耐鹽性的不同而不同。

本試驗從研究鹽脅迫下細胞的超微結構出發(fā)，尋找衡量二倍體馬鈴薯耐鹽性的強弱細胞學指標，結果表明，細胞膜、葉綠體和線粒體都可以作為衡量二倍體馬鈴薯耐鹽性強弱的細胞學指標。

[1]龔家棟．馬鈴薯不同品種耐鹽性差異初步研究[J]．中國沙漠,1996,16(1)∶61-66．

[2]尹江,馬恢,崔紅軍．馬鈴薯親本材料試管苗的耐鹽性篩選[J]．中國馬鈴薯,2005,19(1)∶13-16．

[3]康玉林,張春震,夏佃仁,等．鹽堿地馬鈴薯品種適應性研究[J]．馬鈴薯雜志,1997,11(1)∶7-10．

[4]李娟,程智慧,張國裕．馬鈴薯耐鹽突變體的離體篩選[J]．西北農(nóng)林科技大學學報∶自然科學版,2004,32(8)∶44-48．

[5]王新偉,滕偉麗,馬異泉,等．鹽脅迫下馬鈴薯脫毒苗生物產(chǎn)量及VC含量的變化[J]．東北農(nóng)業(yè)大學學報,2000,31(3)∶221-224．

[6]張俊蓮,陳勇勝,武季玲,等．鹽脅迫下馬鈴薯耐鹽相關生理指標變化的研究[J]．中國馬鈴薯,2002,16(6)∶323-327．

[7]KhraisT,LeclercY,DanielleJD．Relativesalinitytoleranceofpotato cultivars assessed by in vitro screening[J]．Amer J Potato Res,1998,75(5)∶207-210．

[8]Shaterian J,Waterer D R,De Jong H,et al．Methodologies and traits for evaluating the salt tolerance in diploid potato clones[J]．Am J Pot Res,2008,85∶93-100．

[9]Velasquez B,Balzarini M,Taleisnik E．Salt tolerance variability amongst Argentine Andean potato(Solanum tuberosum L．subsp.andigena)[J]．Potato Research,2005,4(4)∶59-67．

[10]Bruns S,Hecht-Buchholz C．Light and electron-microscope studies on the leaves of several potato cultivars after application of salt at various developmental stages[J]．Potato Res,1990,33∶33-41．

[11]RossH．Potato-breeding problems and perspectives[M]．Berlin∶Verlag Paul Parey,1986∶132．

[12]Murphy A M,De Jong H,Tai G C C．Transmission of resistance to common scab from the diploid to the tetraploid level via 4x×2x crosses in potatoes[J]．Euphytica,1995,82∶227-233．

[13]Watanable K,El-Nashaar H,Iwanaga M．Transmission of bacterial wilt resistance by FDR 2n pollen via 4x × 2x crosses in potatoes[J]．Euphytica,1992,60∶21-26．

[14]王茅雁,邵世勤,張建華,等．水分脅迫對玉米保護酶系活力及膜系統(tǒng)結構的影響[J]．華北農(nóng)學報,1995,10(2)∶43-49．

[15]劉愛峰,趙檀方,段友臣．鹽脅迫對大麥葉片細胞超微結構影響的研究[J]．大麥科學,2000(3)∶20-22．

[16]Mitsuya S,Takeoka Y,Miyake H．Effects of sodium chloride on foliar ultrastructure of sweet potato plantlets grown under light and dark conditions in vitro[J]．Plant Physiol,2000,157∶661-667．

[17]Smith M M,Hodson M J．Salt-induced ultrastructural damage to mitochondria in root tips of a salt-sensitive ecotype of Agrostis stolonifera[J]．Exp Bot,1982,23(5)∶86-895．

[18]Ciamporova M．Ultrastructure of cortical cells of maize root under water stress conditions[J]．Biologia Plant,1980(22)∶444-449．

[19]鄭文菊,王勛陵,賈敬芬．西安小麥耐鹽系愈傷組織細胞的超微結構觀察[J]．西北植物學報,1999,19(1)∶81-84．

[20]徐鵬飛,張淑珍,吳俊江,等．大豆疫霉根腐病菌毒素對抗感不同大豆品種根部超微結構的影響[J]．東北農(nóng)業(yè)大學學報,2009,40(4)∶1-5．