蕓薹屬植物對(duì)四種土傳病原微生物熏蒸效果的研究

喬世佳，李淑敏*，孟令波,2

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030；2.哈爾濱學(xué)院生物與化學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150086）

生物熏蒸是利用含有硫代葡萄糖苷的植物，抑制或殺死土壤中有害生物的一種土壤消毒方法[1]。硫代葡萄糖苷在植物組織受到切碎、咀嚼等傷害時(shí)會(huì)引發(fā)“芥子氣爆炸”，降解成一系列的水解產(chǎn)物[2]，其中的異硫氰酸酯具有抑制植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)[3-4]、雜草[5]、病原真菌[6]的功能，并能改善土壤結(jié)構(gòu)，提高作物產(chǎn)量[7]。目前已經(jīng)證明，利用芥菜、甘藍(lán)、蕪菁等蕓薹屬植物提取物進(jìn)行土壤熏蒸，能夠抑制馬鈴薯疫霉緋腐病菌（Phytophthora erythroseptica）、菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、根腐絲囊霉（Aphanomyces euteiches）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、黃萎?。╒.dahliae）等土傳病害[8-12]。然而，蕓薹屬不同植物間以及同一植物不同品種間的硫代葡萄苷濃度和降解產(chǎn)物異硫氰酸酯形式都具有很大的差異，其所起作用也受環(huán)境條件和植物生長(zhǎng)狀況影響。為了確定蕓薹屬植物對(duì)更多種類(lèi)的土傳病害是否具有潛在的抑制能力，以及是否特定蕓薹屬植物對(duì)特定土傳病害有更好的控制效果。本研究通過(guò)培養(yǎng)皿試驗(yàn)，以抑菌率、菌絲干重、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率四個(gè)指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)春夏秋冬小白菜、蘇州青油菜、小花葉芥菜、紅圓蕪菁、香港遲花芥藍(lán)和香港白花芥藍(lán)等六種蕓薹屬植物對(duì)黃瓜枯萎病、黃瓜灰霉病、黃瓜立枯病和水稻稻瘟病等四種病原菌的抑制效果，從中選出具有較好生物熏蒸能力的植物材料，為進(jìn)一步利用生物熏蒸技術(shù)防治土傳病害提供新的思路，為揭示硫代葡萄糖苷抑菌機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌種為黃瓜枯萎?。‵usarium oxysporu f.sp.cucumerinum Owen）、黃瓜灰霉?。˙otrytis cinerea）、黃瓜立枯?。≧hizoctonia solani Kahn）、水稻稻瘟?。≒yricularia grisea（Cooke）Sacc.），均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院采集、分離和保存。供試植物材料為春夏秋冬小白菜（B.chinensis L.）、蘇州青油菜（B.campestris L.）、香港遲花芥藍(lán)（B.albograbra Bailey）和香港白花芥藍(lán)（B.albograbra Bailey）的莖葉，小花葉芥菜（B.juncea）和紅圓蕪菁（B.rapa）的塊根。六種蔬菜均為作者種植所得。

1.2 方法

1.2.1 植物提取液的制備和菌種的準(zhǔn)備

采集生長(zhǎng)50 d左右的新鮮植物的莖葉和塊根，清洗干凈，用5%的NaClO溶液表面消毒3 min，用無(wú)菌水沖洗后切成小塊，將60 g植物組織與20 mL蒸餾水混勻后，用榨汁機(jī)將植物組織打碎，紗布過(guò)濾，-80℃保存?zhèn)溆?。將保存的四種病菌菌株恢復(fù)活性，純化培養(yǎng)于PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL）中備用。

1.2.2 不同蕓薹屬植物對(duì)病原菌抑菌率的測(cè)定

用直徑為0.5 cm的打孔器在菌落邊緣打孔，取生長(zhǎng)水平相同的菌餅接種于已倒有PDA平板的9.0 cm培養(yǎng)皿中央，然后加入4 mL植物提取液（加入4 mL蒸餾水為空白對(duì)照），迅速將接種菌餅的培養(yǎng)皿底蓋蓋上，置28℃培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)。每處理4次重復(fù)。每隔24 h測(cè)定1次菌落直徑，連續(xù)測(cè)定6次，以第6次菌落直徑大小衡量不同植物材料對(duì)病原菌的熏蒸抑菌能力。

1.2.3 不同蕓薹屬植物對(duì)病原菌的生物量累積的測(cè)定

用打孔器將四種病原菌接種于鋪有無(wú)菌玻璃紙的 PDA平板中央，取植物提取液（4 mL）按1.2.2方法熏蒸6 d后，刮下玻璃紙上的菌絲，裝入塑料管內(nèi)。60℃烘烤72 h后測(cè)定干重，以確定生物熏蒸處理對(duì)不同病原菌生物量累積的影響。設(shè)4 mL蒸餾水的處理為空白對(duì)照，重復(fù)4次。

1.2.4 不同蕓薹屬植物對(duì)病原菌的產(chǎn)孢量和所產(chǎn)孢子萌發(fā)率的測(cè)定

按1.2.3所述方法，經(jīng)4 mL植物提取液生物熏蒸處理6 d后刮下菌絲，放入裝有20 mL無(wú)菌水的離心管中，振蕩器上搖勻，過(guò)200目無(wú)菌鋼篩后定容至20 mL，取濾液滴于血球計(jì)數(shù)板，顯微鏡下計(jì)數(shù)。重復(fù)測(cè)定3次。將孢子懸浮液稀釋到10-4倍，涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基平板上，測(cè)定所產(chǎn)孢子的萌發(fā)率[13]。重復(fù)測(cè)定3次。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

采用Excel 2003和SAS 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蕓薹屬植物對(duì)病原菌抑菌率的測(cè)定

由表1可知，在熏蒸第6天，六種蕓薹屬植物提取液對(duì)四種植物病原菌都有抑制效果，與對(duì)照相比均有顯著差異，但程度不同；芥菜的抑菌程度最高，對(duì)四種植物病原菌的抑菌率均為100%，顯著高于其他五種植物；紅圓蕪菁對(duì)黃瓜枯萎病、黃瓜灰霉病、黃瓜立枯病和水稻稻瘟病的抑菌率分別為55.7%、62.7%、79.9%、60.5%，除芥菜外，與其他四種植物相比抑菌作用明顯。在5%的顯著水平上遲花芥藍(lán)與白花芥藍(lán)對(duì)四種植物病原菌的抑菌效果有顯著差異，前者的抑菌效果高于后者；油菜對(duì)四種植物病原菌的抑菌率均高于40%；白菜除對(duì)黃瓜枯萎病的抑菌率為37.8%外，對(duì)其他病菌的抑菌率均高于40%；油菜和白花芥藍(lán)抑菌效果無(wú)顯著差異。

表1 六種蕓薹屬植物對(duì)四種病原菌的抑菌效果Table 1 Inhibiting effects of six Brassica plants on the four pathogens

由圖1可知，小花葉芥菜對(duì)四種土傳病害病菌都有直接殺死效果。春夏秋冬小白菜、蘇州青油菜、紅圓蕪菁、香港遲花芥藍(lán)、香港白花芥藍(lán)等其他五種蕓薹屬植物對(duì)病原真菌只起抑制作用，其抑菌效果隨時(shí)間延長(zhǎng)產(chǎn)生改變，最大抑菌效果均在第1天，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，總體上呈現(xiàn)先降后升的規(guī)律，且最后的抑菌效果均低于第1天。這說(shuō)明生物熏蒸的抑菌效果會(huì)隨著時(shí)間的推移而逐漸下降。

圖1 六種蕓薹屬植物隨時(shí)間變化對(duì)四種土傳病病菌的抑制Fig.1 Inhibition of six different treatments conditions on the four pathogens with time change

2.2 不同蕓薹屬植物對(duì)病原菌生物量累積的影響

結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2表明，六種蕓薹屬植物對(duì)四種土傳病害病原菌生物量積累均有明顯的抑制作用，但抑制效果不同。小花葉芥菜對(duì)四種土傳病害病原菌生物量積累的抑制效果最佳，經(jīng)其處理后，各菌菌絲干重均為0 mg。其余五種蕓薹屬植物抑制效果高低排序?yàn)椋杭t圓蕪菁＞香港遲花芥藍(lán)＞香港白花芥藍(lán)＞蘇州青油菜＞春夏秋冬小白菜。除小花葉芥菜對(duì)所有病原菌生物量積累完全抑制外，另外五種植物對(duì)黃瓜枯萎病病原菌生物量積累的抑制效果均強(qiáng)于其他三種土傳病害。

圖2 六種蕓薹屬植物對(duì)四種土傳病害病原菌生物量積累的影響Fig.2 Effect of six different treatments on four pathogens biomass accumulation

2.3 不同蕓薹屬植物對(duì)病原菌產(chǎn)孢量與孢子萌發(fā)率的影響

結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3表明，經(jīng)六種蕓薹屬植物處理，四種土傳病害病原菌的產(chǎn)孢量明顯低于對(duì)照。由此可知，蕓薹屬植物明顯抑制了植物病原菌分生孢子的產(chǎn)生，但抑制效果不同。小花葉芥菜對(duì)四種土傳病害病原菌產(chǎn)孢量的抑制效果最佳，經(jīng)其處理后，各菌產(chǎn)孢量為0。其余五種蕓薹屬植物抑制效果高低排序?yàn)椋杭t圓蕪菁＞香港遲花芥藍(lán)＞香港白花芥藍(lán)＞蘇州青油菜＞春夏秋冬小白菜。除小花葉芥菜對(duì)所有病原菌生物量積累完全抑制外，另外五種植物對(duì)黃瓜枯萎病菌病原菌產(chǎn)孢量的抑制效果均強(qiáng)于其他三種土傳病害。

圖3 六種蕓薹屬植物對(duì)四種土傳病害病原菌產(chǎn)孢量的影響Fig.3 Effect of six different treatments on four pathogens spores

由表2可知，小花葉芥菜、紅圓蕪菁、香港遲花芥藍(lán)、香港白花芥藍(lán)等四種植物對(duì)四種土傳病害病原菌孢子萌發(fā)有顯著的抑制作用，經(jīng)它們處理后，病原菌孢子萌發(fā)率顯著低于對(duì)照。小花葉芥菜完全抑制四種土傳病害病原菌孢子萌發(fā)，抑制效果其次的是紅圓蕪菁，其中對(duì)黃瓜立枯病的孢子萌發(fā)也達(dá)到了完全抑制。對(duì)病原菌孢子萌發(fā)抑制較弱的是蘇州青油菜和春夏秋冬小白菜，尤其是春夏秋冬小白菜，除對(duì)黃瓜枯萎病孢子萌發(fā)有一定的抑制作用外，對(duì)另三種病害均無(wú)明顯抑制效果。以上分析表明，不同蕓薹屬植物對(duì)土傳病害病原菌孢子萌發(fā)的抑制存在差異，而且同種蕓薹屬植物對(duì)不同土傳病害病原菌孢子萌發(fā)的抑制也存在差異。

表2 六種蕓薹屬植物對(duì)四種土傳病害病原菌孢子萌發(fā)率的影響Table 2 Effect of six different treatments on four pathogen spores germination rate

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)隨著化學(xué)農(nóng)藥的使用造成有害物質(zhì)在土壤中富集，不僅危害人類(lèi)健康，還破壞生態(tài)平衡并對(duì)脊椎動(dòng)物有毒害作用[14-17]。這推動(dòng)了人們尋找更好的良性替代品[18]。而生物熏蒸由于具有污染少、危害低、減少水土流失、改善土壤肥力等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越被人們所重視[7]。諸多研究表明，蕓薹屬植物在防治土壤病蟲(chóng)害方面具有良好的效果。2006年，李明社等報(bào)道用蕓薹屬植物進(jìn)行土壤消毒[1]，效果優(yōu)于太陽(yáng)能和土壤還原消毒法；2007年，Larkin等報(bào)道用蕓薹屬植物控制多種馬鈴薯病蟲(chóng)害[8]，防治效果明顯；2007年，范成明等報(bào)道在對(duì)病原菌防治方面蕓薹屬植物要好于非蕓薹屬植物[19]。本研究表明，春夏秋冬小白菜、蘇州青油菜、小花葉芥菜、紅圓蕪菁、香港遲花芥藍(lán)和香港白花芥藍(lán)等六種蕓薹屬植物對(duì)黃瓜枯萎病、黃瓜灰霉病、黃瓜立枯病和水稻稻瘟病等四種病原菌具有抑制效果，進(jìn)一步證明了蕓薹屬植物在防治土壤病害方面的良好效果。研究中還表明，不同蕓薹屬植物對(duì)病原菌的抑制效果存在差異，小花葉芥菜抑制效果最好，其次為紅圓蕪菁、香港遲花芥藍(lán)、香港白花芥藍(lán)和蘇州青油菜，春夏秋冬小白菜抑菌效果最弱；同種蕓薹屬植物對(duì)不同土傳病害病原菌抑制也存在差異，試驗(yàn)植物對(duì)黃瓜立枯病的抑制效果要好于其他三種病害。

蕓薹屬植物對(duì)于病原菌的抑菌強(qiáng)弱，主要取決于其所含硫代葡萄糖苷的種類(lèi)和含量。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，芥菜中主要硫苷成分是2-丙稀基硫苷（占85%以上）[20]；芥藍(lán)中3-丁烯基硫苷為主要硫苷[21]；蕪菁中最主要硫苷為3-丁烯基硫苷，其次為苯乙基硫苷[21]；小白菜中的主要硫苷為3-丁烯基硫苷和1-甲氧基-3-吲哚基甲基硫苷[22]；油菜中主要含有3-丁烯基硫苷和4-戊烯基硫苷（兩者占80%以上）[23]。由此可以得出，本試驗(yàn)所選用的六種蕓薹屬植物所含硫代葡萄糖苷的含量和總類(lèi)是不同的，它們所釋放的揮發(fā)性物質(zhì)的熏蒸效果也不相同，具體是哪種硫苷的分解產(chǎn)物在起作用，還需要進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)雖然只是在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)檢驗(yàn)植物提取液對(duì)四種病原菌的抑菌效果，但為今后利用蕓薹屬植物在土傳病害的治理方面提供了理論依據(jù)，但如何最大限度地使蕓薹屬植物材料中的硫代葡萄糖苷快速水解成異硫氰酸酯，提高其生物熏蒸效果，還有待于在田間試驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。

[2]Halkier B A,Gershenzon J.Biology and bioehemistry of glueosinolates[J].The Annual Review of Plant Biology,2006,57∶303-333.

[3]Riga E,Mojtahedi H,Ingham R E,et al.Green manure amendments and management of root-knot nematodes on potato in the Pacific Northwest of USA[J].Nematology Monographs and Perspectives,2004(2)∶151-158.

[4]Zasada I A,Ferris H.Nematode suppression with brassicaceous amendments application based upon glucosinolate profiles[J].Soil Biology and Biochemistry,2004,36(3)∶1017-1024.

[5]Brown P D,Morra M J.Glucosinolate containing plant tissues as bioherbicides[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1995,43∶3070-3074.

[6]Kirkegaard J A,Wong P T W,Desmarchelier J M.In vitro suppression of fungal root pathogens of cereals by Brassica tissues[J].Plant Pathology,1996,45∶593-603.

[7]Matthiessen J N,Kirkegard J A.Biofumigation and enhanced biodegradation∶opportunity and challenge in soilborne pest and disease management[J].Critical Reviews in Plant Sciences,2006,25∶235-265.

[8]Larkin R P,Griffin T S.Control of soilborne potato diseases using Brassica green manures[J].Crop Protection,2007,26∶1067-1077.

[9]Lewis J A,Papavizas G C.Effect of sulfur-containing volatile compounds and vapors from cabbage decomposition on Aphanomyces euteiches[J].Phytopathology,1971,61∶208-214.

[10]Smolinska U,Morra M J,Knudsen G R,et al.Isothiocyanates produced by Brassicaceae species as inhibitors of Fusarium oxysporum[J].Plant Dis,2003,87∶407-412.

[11]Charron C S,Sams C E.Inhibition of Pythium ultimum and Rhizoctonia solani by shredded leaves of Brassica species[J].J Am Soc Hort Sci,1999,124∶462-467.

[12]Mayton H S,Olivier C,Vaughn S F,et al.Correlation of fungicidal activity of Brassica species with allyl isothiocyanate production in macerated tissue[J]Phytopathology,1996,86∶267-271.

[13]方中達(dá).植病研究方法[M].北京∶農(nóng)業(yè)出版社,1998.

[14]李云龍,李孱,李景鵬,等.微生物技術(shù)在農(nóng)業(yè)和環(huán)保中的應(yīng)用[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1996,27(4)∶406-413.

[15]Cox C.Fumigant factsheet∶metam sodium[J].Journal of Pesticide Reform,2006,26∶12-16.

[16]Schreiner R P,Ivors K L,Pinkerton J N.Soil solarization reduces arbuscular mycorrhizal fungi as a consequence of weed suppression[J].Mycorrhiza,2001(11)∶273-277.

[17]李永剛,文景芝,郝中娜.植物源殺菌劑的研究現(xiàn)狀與展望[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,33(2)∶198-202.

[18]Martin F N.Development of alternative strategies for management of soilborne pathogens currently controlled with methyl bromide[J].Annual Review of Phytopathology,2003,41∶325-350.

[19]范成明,劉建英,吳毅歆,等.具有生物熏蒸能力的幾種植物材料的篩選[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)∶自然科學(xué)版,2007,22(5)∶654-658.

[20]陳新娟.中國(guó)蕓薹屬蔬菜硫代葡萄糖苷及其影響因子研究[D].杭州∶浙江大學(xué),2006.

[21]陳新娟,周勝軍.3個(gè)蕪菁品種硫代葡萄糖苷含量的比較研究[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2009(2)∶415-417.

[22]何洪巨,陳杭.蕓薹屬蔬菜中硫代葡萄糖苷鑒定與含量分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2002,35(2)∶192-197.

[23]黃界潁,馬友華.油菜硫甙特征功能及其測(cè)定方法[J].植物生理學(xué)通訊,2003,39(5)∶496-500.