便秘二號方對慢傳輸型便秘大鼠Cajal間質(zhì)細(xì)胞及C-KIT表達(dá)的影響

楊關(guān)根，劉智勇，楊琴燕，金建芬

便秘二號方對慢傳輸型便秘大鼠Cajal間質(zhì)細(xì)胞及C-KIT表達(dá)的影響

楊關(guān)根1，劉智勇1，楊琴燕1，金建芬2

目的：觀察便秘二號方對結(jié)腸慢傳輸型便秘大鼠模型的療效，并檢測其對大鼠模型結(jié)腸組織Cajal間質(zhì)細(xì)胞及C-KIT表達(dá)的影響。方法：32只大鼠隨機分為正常組、模型組、實驗組、鹽水對照組，每組8只。正常組給予正常飲食，其余3組采用大黃遞增灌胃法制作慢傳輸型便秘大鼠模型。造模成功后，實驗組予中藥便秘二號方(方由當(dāng)歸、白術(shù)、黃芪、升麻、杏仁、枳實、肉蓯蓉組成）灌胃，鹽水對照組予生理鹽水灌胃。30 d后以活性炭灌胃法檢測結(jié)腸傳輸功能，以免疫組化法觀察結(jié)腸組織Cajal間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量，采用RT-PCR法觀察C-KIT mRNA表達(dá)。結(jié)果：炭末推進長度模型組明顯少于正常組（P＜0.05），實驗組明顯高于鹽水對照組（P＜0.05），推進率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；實驗組與鹽水對照組相比，可見各肌層Cajal間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)；實驗組與鹽水對照組的Cajal間質(zhì)細(xì)胞個數(shù)比較，實驗組高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；模型組C-KIT表達(dá)陽性率明顯低于正常組，實驗組C-KIT表達(dá)陽性率明顯高于鹽水對照組。結(jié)論：中藥便秘二號方可以增強慢傳輸型便秘大鼠的結(jié)腸蠕動功能，增加結(jié)腸組織中Cajal間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量，改善其形態(tài)，促進C-KIT表達(dá)。

結(jié)腸慢傳輸型便秘；便秘二號方；Cajal間質(zhì)細(xì)胞；C-kit蛋白

結(jié)腸慢傳輸型便秘（slow transit costipation，STC）指結(jié)腸運動障礙、結(jié)腸內(nèi)容物推進速度減慢或結(jié)腸收縮乏力。Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of cajal，ICC)是胃腸道神經(jīng)系統(tǒng)的一種非神經(jīng)但又與神經(jīng)密切相關(guān)的特殊間質(zhì)細(xì)胞,可能是腸道慢波的起博者，有潛在的控制胃腸道動力的作用。ICC減少在STC患者結(jié)腸動力障礙的發(fā)生機制中有非常關(guān)鍵的作用。酪胺酸激酶受體c-kit是ICC細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。本課題采用免疫組化和RT-PCR技術(shù)研究便秘二號方對STC大鼠結(jié)腸組織ICC及c-kit表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Wistar大鼠32只，雌雄各半，清潔級，體重(200±10)g，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供（許可證號:SCXK滬2007-0005），由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑和儀器 冰凍包埋切片機（德國Leica CM1900）；PCR儀（BIO-RAD公司，美國）；-4℃離心機（德國Eppendorf公司）；電泳儀（NYCP-34ACG,北京六一儀器廠）；紫外分光光度儀Smartspec3000型（美國BIO-RAD公司）；紫外燈透射凝膠成像儀系統(tǒng)（GELDOC,美國BIO-RAD公司）；微型漩渦混合器（H-1,上海精科實業(yè)有限公司）；兔多抗c-kit抗體（一抗）（美國Santa Cruz公司）；兔／鼠兩步法試劑盒（二抗）（北京中杉）；丙酮；PBS；DAB顯色液（北京中杉）；異丙醇（-5-）；RT試劑盒（立陶宛Fermentas）；PCR試劑盒（美國Promega）; Trizol（美國Promega）；DEPC水（美國Promega）；DNAmark（美國Promega）；大鼠c-kit上下游引物（由上海生工合成）:上游5’-AGTGGATGACCTC GTG GC-3’；下游5’-GTATTACTGCTACTGCTGTC-3’，產(chǎn)生285 bp的產(chǎn)物；大鼠β-actin上下游引物（由上海生工合成），上游5’-CATCTATGAGGGTTACGCG-3’,下游5’-CCAG GATAGAGCCACCAAT-3’，產(chǎn)物長度548 bp。

便秘二號方：當(dāng)歸15 g，白術(shù)30 g，黃芪30 g，升麻9 g，杏仁10 g，枳實9 g，肉蓯蓉15 g等，由杭州市第三人民醫(yī)院中藥房水煎濃縮成200%煎劑。大黃粉約700 g（由杭州市第三人民醫(yī)院中藥房提供）。

1.3 分組及給藥 32只大鼠隨機分為4組，每組8只。正常組予正常飼料和水喂養(yǎng)，另外24只制做成STC大鼠模型后分為模型組、鹽水對照組和實驗組。實驗組每只大鼠灌服便秘二號方10 mL/(kg·d)，約含生藥2 g/mL，鹽水對照組每只大鼠灌服生理鹽水10 mL/(kg·d)。連續(xù)灌藥30 d。模型組和正常組同樣予以正常飼料和水喂養(yǎng)。

1.4 造模 造模方法根據(jù)文獻[1]，模型組大鼠正常每日灌服大黃粉懸液，開始時大黃的用量為600 mg/(kg·d),以后每日在前日的基礎(chǔ)上加倍，直到出現(xiàn)半數(shù)致瀉保持此劑量到80%稀便消失。然后再在此基礎(chǔ)上加倍給藥，又有近半數(shù)大鼠出現(xiàn)腹瀉。如此循環(huán)3次，待最后80%稀便消失1周后停藥。誘導(dǎo)實驗性STC大鼠模型。

1.5 標(biāo)本采集 正常組和模型組造模成功1周，鹽水對照組及實驗組在停止灌胃1周后，均禁食不禁水24 h，用10%的活性炭懸液2 mL灌胃30 min后頸椎脫臼處死。立即剖腹，在橫結(jié)腸部位取新鮮腸壁組織,置10%中性甲醛固定液中,用于形態(tài)學(xué)觀察及免疫組化實驗。

1.6 觀察指標(biāo)與方法

1.6.1 活性碳推進試驗檢測腸道傳輸功能 碳末推進百分率(%)=(碳末前端與幽門的距離/腸道全長)× 100。摘除從幽門到直腸末端的全部腸道，在松弛狀態(tài)下測量腸道的全長及活性碳混懸液在腸道內(nèi)推進的長度，并計算活性碳混懸液推進長度與腸道全長的百分比。

1.6.2 Cajal間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察 腸壁組織取出后放于冰凍切片機中，用OCT包埋，切片，HE染色。每張切片染色陽性區(qū)域隨機選擇5個高倍鏡視野（200×）觀察，并選擇結(jié)腸區(qū)域環(huán)肌層在400倍光學(xué)顯微鏡下數(shù)陽性細(xì)胞個數(shù)，以每個高倍鏡視野下陽性細(xì)胞個數(shù)的平均值做統(tǒng)計學(xué)分析。

1.6.3 總RNA的提取 100 mg結(jié)腸組織用PBS沖洗兩次，放入研缽中加液氮研磨成粉末狀，然后加Trizol 1 mL（4℃），吹打組織溶解，收集在Eppendof管中，冰浴下超聲破碎細(xì)胞5 s×3，每管加0.2 mL氯仿，振蕩15 s后靜置10 min，12 000 r/min 4℃離心15 min，轉(zhuǎn)上層水相（約400 μL）于另一1.5 mL EP管中加等體積異丙醇，混勻，室溫10 min，12 000 r/min離心10 min，棄上清，加預(yù)冷的75%乙醇1 mL，7 500 r/min 4℃離心5 min，棄上清，干燥后溶于DEPC水中30 μL。

1.6.4 C-kitmRNA表達(dá)的RT-PCR反應(yīng) 紫外分光光度定量記錄每個樣本RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄步驟按照試劑盒說明書進行。再PCR擴增，反應(yīng)條件為95℃5 min，94℃30 s，55℃30 s, 72℃1 min，36次循環(huán)，末次循環(huán)后72℃再延伸7 min，4℃終止反應(yīng)，電泳30 min后，紫外燈下觀察目的片斷，用DNAmark測量條帶分子量，證明PCR產(chǎn)物正確。有分子量相符片斷者標(biāo)志為陽性，無則標(biāo)志為陰性。將每組C-KIT表達(dá)陽性和陰性例數(shù)計數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計。各組數(shù)據(jù)采用表示，計量資料比較用兩樣本t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。以P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 炭末推進情況 模型組和正常組比較，模型組炭末推進長度小于正常組（P＜0.05），炭末推進率明顯小于正常組（P＜0.01）；實驗組與對照組比較，實驗組炭末推進長度大于對照組（P＜0.05），推進率高于對照組（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠炭末推進長度以及推進率的比較

表1 各組大鼠炭末推進長度以及推進率的比較

注：與正常組比較，*P ＜0.05，**P＜0.01；與對照組比較,ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01

組別 n 腸道全長(cm)炭末推進長度(cm) 百分比（%）正常組 8 110.00±6.16 66.12±4.52 66.80±8.15模型組 8 110.50±5.86 58.88±5.87* 53.41±5.94**實驗組 8 117.00±6.70 69.45±5.57Δ 59.97±3.91ΔΔ對照組 8 116.00±7.31 57.14±6.62 50.06±5.58

2.2 大鼠結(jié)腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)及分布觀察 免疫組化DAB顯色后光鏡下觀察,正常組見Cajal間質(zhì)細(xì)胞胞膜和突起呈棕黃色，分布于整個結(jié)腸各肌層，但以環(huán)肌層最豐富。兩組對照組與正常組相比各肌層Cajal間質(zhì)細(xì)胞均有所改變。特別是環(huán)肌層和黏膜下環(huán)肌層表面區(qū)域更為明顯，部分消失。殘存的Cajal間質(zhì)細(xì)胞其形態(tài)也出現(xiàn)異常，往往表現(xiàn)為突起變短、變鈍。

2.3 大鼠結(jié)腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量改變 平均每個高倍鏡視野下Cajal間質(zhì)細(xì)胞陽性細(xì)胞個數(shù)比較，模型組（48.50±5.93）比正常組（97.00± 10.84）明顯減少（P＜0.01），實驗組（80.63±5.04）比鹽水對照組（56.75±9.82）明顯增多（P＜0.01）。

2.4 大鼠結(jié)腸c-kit mRNA表達(dá) 大鼠結(jié)腸組織中c-kit mRNA基因的表達(dá)結(jié)果,正常組陽性率高于模型組，實驗組高于對照組。見表2。

表2 大鼠結(jié)腸組織c-kit mRNA表達(dá)

3 討論

近來的研究發(fā)現(xiàn)，Cajal間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量及分布的改變在STC的發(fā)病中可能起著重要的作用[2]。有人發(fā)現(xiàn)STC患者乙狀結(jié)腸全層Cajal間質(zhì)細(xì)胞的體積顯著減少，結(jié)腸環(huán)形肌層的神經(jīng)結(jié)構(gòu)也減少，提示Cajal間質(zhì)細(xì)胞的體積減少可能在STC的病理生理中起重要作用[3]。長期服用刺激性瀉劑可導(dǎo)致結(jié)腸黏膜、平滑肌和壁內(nèi)神經(jīng)病變，形成所謂“瀉劑結(jié)腸”，而STC患者一般均有長期服用各類瀉劑的病史。國內(nèi)動物實驗研究模仿STC患者服用瀉劑的特點(服用劑量越來越大，而瀉下作用越來越差)，應(yīng)用常用的接觸性瀉劑酚酞或者大黃制成大鼠“瀉劑結(jié)腸”模型，發(fā)現(xiàn)其瀉劑結(jié)腸肌間叢Cajal間質(zhì)細(xì)胞分布極不均勻，突起連接雜亂或不能相互連接形成網(wǎng)絡(luò)。因而推測大鼠“瀉劑結(jié)腸”結(jié)腸肌間叢Cajal間質(zhì)細(xì)胞分布和網(wǎng)絡(luò)的雜亂性是結(jié)腸慢波頻率減慢的病理基礎(chǔ)［4］。c-kit為一種原癌基因,位于5號染色體w位點上,它編碼kit受體,后者屬酪氨酸激酶膜受體。在ICC表達(dá)均表達(dá)c-kit,并且ICC能通過kit受體接受各種信號,如果阻斷kit受體,不但ICC發(fā)育受到影響,而且其功能也將喪失,故ICC有無c-kit表達(dá)與腸道動力密切相關(guān),因此可以利用c-kit抗體標(biāo)記識別ICC。本實驗研究結(jié)果表明，大鼠慢傳輸便秘模型結(jié)腸組織中各肌層ICC數(shù)量明顯少于正常大鼠，且在形態(tài)上有所改變，表現(xiàn)為變短、變鈍。用分子生物學(xué)方法研究慢傳輸型便秘大鼠結(jié)腸組織中c-kitmRNA表達(dá)產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)c-kitmRNA表達(dá)幾乎檢測不出，但是正常大鼠結(jié)腸組織中c-kitmRNA表達(dá)基本正常。

有人認(rèn)為脾虛氣弱是STC的基本病機，健脾益氣是治療STC的基本大法并通過實驗證明提示生白術(shù)可以顯著增強結(jié)腸縱肌和橫肌的收縮作用［5］。臨床運用表明，白術(shù)能有效治療便秘。便秘二號方由黃芪、當(dāng)歸、白術(shù)、枳殼、肉蓯蓉等組成，以補氣健脾潤腸為基本大法，黃芪和白術(shù)用量達(dá)到30 g，臨床效果明顯。本實驗給慢傳輸型便秘大鼠灌服便秘二號方1個月后，大鼠腸鳴音明顯較前活躍，活動范圍和進食量增加，大便軟而成形。對照組大便顆粒較干結(jié)，大鼠活動能力下降，喜歡扎堆，毛發(fā)糾結(jié)。實驗組大鼠腸道傳輸速度較對照組有明顯提高，而且大鼠結(jié)腸組織Cajal間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加，形態(tài)恢復(fù)正常，接近正常組大鼠，C-kitmRNA的表達(dá)也有所恢復(fù)。表明便秘二號方能夠糾正c-kitmRNA的過低表達(dá)，改善結(jié)腸組織中的Cajal間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和功能，使慢傳輸型便秘大鼠結(jié)腸功能恢復(fù)正常。

[1]張連陽,高峰,童衛(wèi)東,等.大鼠瀉劑結(jié)腸模型的建立[J].華人消化雜志,1998,6(10):864.

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[5]丁曙晴，丁義江，郭榮,等.白術(shù)對豚鼠結(jié)腸體外肌條運動的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2005,13（2）：102.

（收稿：2009-08-10修回：2009-12-22）

（責(zé)任編輯 劉洪斌 田在善）

Effect of Bianmi（便秘）No.2 Decoction on Interstitial Cells of Cajal and c-kit Expression in Slow Transit Constipation Rats

Yang Guangen,Liu Zhiyong,Yang Qinyan,et al The 3rd People’s Hospital of Hangzhou,Hangzhou(310009),China

Objective To study the effect of Chinese herbal medicine Bianmi’（便秘）Decoction on distribution and the morphology and quantity of interstitial cells of Cajal(ICC)as well as expression of c-kit mRNA in the colon tissue of slow transit constipation(STC)rats. Methods Thirty-two rats were divided into 4 groups randomly(8 rats each).The normal group was fed with normal food,the other three groups were induced into STC rats models with gavaging Dahuang.The experimental group was gavaged with Bianmi No. Decoction,10 mL/kg including crude drug 2 g/mL for 30 days.The control group was gavaged with the same volume saline.Then,the carbon powder propulsion rates in the intestine were measured and specimens were taken.The variation of morphology and number and expression of c-kit mRNA in ICC in the two groups were measured. Results Carbon powder propulsion length in the model group was shorter than that of the normal group(P＜0.05),and carbon powder propulsion rates were lower significantly(P＜0.01).The morphology of ICC became smaller and blunter and the number of ICC became smaller than of control(P＜0.05),the amount of expression of c-kit mRNA in the model group was less than control(P＜0.05). Conclusion Bianmi No, Decoction can resume the morphology and number of ICC in the colon tissue of STC rats and improve the amount of the expression of c-kit mRNA.

slow transit constipation,Bianmi No.2 Decoction，interstitial cells of Cajal,c-kit

R656.9

A

1007-6948(2010)02-0203-04

杭州市科技發(fā)展計劃（20070333Q19）

1.浙江省杭州市第三人民醫(yī)院肛腸科（杭州310009）

2.浙江省杭州市第二人民醫(yī)院肛腸科（杭州310005）

楊關(guān)根,Tel:13957122968,E-mail:Yangguangen88@ 126.com