大鼠重癥急性胰腺炎MODS免疫改變及藥物影響

尤勝義，寇 麗，王春立，薛 強(qiáng)

大鼠重癥急性胰腺炎MODS免疫改變及藥物影響

尤勝義，寇 麗，王春立，薛 強(qiáng)

目的：觀察不同藥物對(duì)重癥急性胰腺炎（SAP）免疫功能的影響。方法：建立大鼠SAP-MODS模型，分別予地塞米松、烏司他丁、善寧、二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC）及中藥萊菔承氣湯治療。觀察各組一般情況及死亡率，術(shù)后24 h血清淀粉酶、TNF-α、IL-6、IL-10及血漿內(nèi)毒素水平，流式細(xì)胞儀對(duì)脾臟T淋巴細(xì)胞亞群比例及凋亡情況進(jìn)行三色熒光分析，并取胰腺、肺、腎、肝臟組織行病理學(xué)檢查。結(jié)果：地塞米松可明顯降低促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6水平，但同時(shí)也使SAP大鼠CD4+T細(xì)胞的異常凋亡進(jìn)一步增加，加劇免疫功能障礙。善寧及PDTC可降低TNF-α和IL-6水平，對(duì)T細(xì)胞功能無(wú)明顯影響。烏司他丁和萊菔承氣湯則可同時(shí)降低促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6及抗炎細(xì)胞因子IL-10水平，減少CD4+T細(xì)胞異常凋亡、改善細(xì)胞免疫功能，明顯降低死亡率、減輕臟器損傷；只有萊菔承氣湯可顯著降低血漿內(nèi)毒素水平。結(jié)論：烏司他丁和萊菔承氣湯有助于調(diào)節(jié)促炎／抗炎反應(yīng)機(jī)制平衡、改善機(jī)體免疫功能，地塞米松可加劇SAP免疫損傷。

重癥急性胰腺炎；免疫功能；T淋巴細(xì)胞亞群；細(xì)胞因子；藥物

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是伴有免疫紊亂的全身性疾病，免疫平衡的重要性在SAP的治療中已逐漸受到關(guān)注。本研究在建立大鼠SAP模型的基礎(chǔ)上，對(duì)比觀察胰腺炎常用治療藥物，包括糖皮質(zhì)激素地塞米松、生長(zhǎng)抑素、善寧、蛋白酶抑制劑烏司他丁以及NF-кB活性阻斷劑PDTC和中藥萊菔承氣湯的療效及對(duì)免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（羅氏公司）；R-PE熒光標(biāo)記CD4單抗及PerCP熒光標(biāo)記CD8單抗（BD公司）；大鼠淋巴細(xì)胞分離液（天津?yàn)笊镏破酚邢薰荆?；大鼠IL-10 ELISA試劑盒（Biosource公司）；大鼠TNF-α、IL-6放免試劑盒（北京科美東雅生物技術(shù)有限公司）；二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC，Sigma公司）；萊菔承氣湯由天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院中藥房提供。方劑組成：川軍（后下）20 g，芒硝15 g，川樸15 g，枳殼10 g，萊菔子15 g，木香10 g，牛膝10 g，加水煎制成200 mL藥液。

1.2 模型制作及分組 健康Wistar大鼠84只，體重220～250 g，隨機(jī)分為對(duì)照組、SAP模型組、地塞米松組、善寧組、烏司他丁組、PDTC組和中藥組，每組12只。采用膽胰管逆行注入5%?；悄懰徕c（1 mL/ kg）的方法[1]建立大鼠SAP模型。各組術(shù)后分別腹腔注射相應(yīng)藥物：地塞米松組1 mg/kg體重，善寧組50 μg/kg體重，烏司他丁組1萬(wàn)U/kg體重，PDTC組10 mg/kg體重，其他組注射生理鹽水0.5 mL，8 h后重復(fù)1次。此外，中藥組萊菔承氣湯2 mL/100 g體重，分兩次灌胃；其他組等量生理鹽水灌胃。

1.3 檢測(cè)指標(biāo) 觀察各組大鼠一般情況及死亡率。血清淀粉酶及血漿內(nèi)毒素測(cè)定：各組大鼠于術(shù)后24 h乙醚吸入麻醉后，無(wú)菌條件下心臟穿刺取血，即刻送檢測(cè)定血清淀粉酶及血漿ET水平。

血清細(xì)胞因子檢測(cè)：其余血標(biāo)本離心分離血清，-20℃保存，ELISA法集中檢測(cè)血清IL-10水平，放免法測(cè)定TNF-α和IL-6水平。

脾淋巴細(xì)胞亞群及凋亡檢測(cè)：各組大鼠于無(wú)菌條件下取脾，獲得單個(gè)核細(xì)胞，于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，使巨噬細(xì)胞貼壁，分離純化所得細(xì)胞懸液即為脾淋巴細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞濃度至2× 107個(gè)/mL，取100 μL細(xì)胞懸液，加入20 μL R-PE標(biāo)記CD4單抗和20 μL PerCP標(biāo)記CD8單抗，常溫避光孵育60 min。采用異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的TUNEL法標(biāo)記凋亡細(xì)胞，以FACS Calibur流式細(xì)胞儀（BD公司）對(duì)已完成表面標(biāo)記及凋亡標(biāo)記的樣本進(jìn)行三色熒光分析。

1.4 病理學(xué)檢查 取大鼠胰腺、肝臟、肺和腎臟置于10%福爾馬林中固定，石蠟切片，HE染色。由專(zhuān)業(yè)病理醫(yī)師閱片，并行胰腺組織半定量病理評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)文獻(xiàn)[2]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 死亡率統(tǒng)計(jì)采用χ2檢驗(yàn)；所有檢測(cè)數(shù)據(jù)均以表示，計(jì)量資料均數(shù)間比較采用單因素方差分析，方差齊性采用LSD法、方差不齊采用Tamhane’s T2法進(jìn)行多重檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況及死亡率 SAP模型組大鼠一般狀況差，出現(xiàn)精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、懶動(dòng)、豎毛、呼吸急促、拒食等表現(xiàn)，24 h死亡率達(dá)50%。各治療組大鼠一般狀況有不同程度改善，以烏司他丁組、PDTC組和中藥組較為明顯，死亡率為16.7%顯著下降，地塞米松組41.7%，善寧組為33.3%，中藥組大鼠術(shù)后24 h內(nèi)出現(xiàn)排便反應(yīng)。

2.2 血清淀粉酶及血漿內(nèi)毒素水平 見(jiàn)表1。

2.3 血清細(xì)胞因子水平 SAP模型組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-10水平均明顯高于對(duì)照組，各治療組均可顯著降低血清TNF-α和IL-6水平，而只有烏司他丁組和中藥組可同時(shí)降低血清IL-10水平，地塞米松組IL-10水平有升高趨勢(shì)。見(jiàn)表2。

表1 各組大鼠血清淀粉酶和血漿內(nèi)毒素水平

表1 各組大鼠血清淀粉酶和血漿內(nèi)毒素水平

注：與對(duì)照組相比，△△P＜0.01;與SAP模型組相比,**P＜0.01

組別對(duì)照組SAP模型組地塞米松組烏司他丁組善寧組PDTC組中藥組n 12 6 7 1 0 8 1 0 10淀粉酶(U/L) 1 983.08±315.41 8 447.83±1 121.04△△7 086.14±1 260.10 4 114.91±893.03**3 459.00±740.84**3 573.94±623.23**3 871.82±779.25**LPS(pg/mL) 24.61±6.26 137.60±27.84△△167.79±38.27 119.07±28.54 121.50±20.41 128.51±28.42 65.76±18.05**

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10水平

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10水平

注：與對(duì)照組相比,△△P＜ 0.01；與SAP模型組相比,*P＜ 0.05,**P＜0.01

組別對(duì)照組SAP模型組地塞米松組烏司他丁組善寧組PDTC組中藥組TNF-α(ng/mL) 0.816 7±0.248 6 2.013 3±0.371 3△△1.704 3±0.173 6*1.431 8±0.293 5**1.590 0±0.261 0**1.240 8±0.341 2**1.330 0±0.270 7**IL-6(pg/mL) 183.44±25.75 397.74±69.23△△308.39±51.95**291.00±39.86**305.86±50.35**245.32±46.82**268.34±35.78**IL-10(pg/mL) 33.16± 8.36 64.86±16.38△△72.83±13.43 42.61± 9.19**57.53±11.65 52.62±10.95 48.96±12.79*

2.4 T淋巴細(xì)胞亞群比例及凋亡分析 SAP模型組大鼠CD4+T細(xì)胞百分比及CD4+/CD8+比值均明顯低于對(duì)照組，同時(shí)CD4+T細(xì)胞凋亡率明顯升高；地塞米松組CD4+T細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高，CD4+T細(xì)胞百分比及CD4+/CD8+比值出現(xiàn)進(jìn)一步下降；烏司他丁組和中藥組CD4+T細(xì)胞凋亡率較SAP組有明顯下降，CD4+T細(xì)胞百分比及CD4+/CD8+比值明顯改善；其余兩組與SAP組之間無(wú)顯著性差異，見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠T淋巴細(xì)胞亞群比例及凋亡檢測(cè)結(jié)果

表3 各組大鼠T淋巴細(xì)胞亞群比例及凋亡檢測(cè)結(jié)果

注：與對(duì)照組相比,△△P＜0.01;與SAP模型組相比,*P＜0.05

組別對(duì)照組SAP模型組地塞米松組烏司他丁組善寧組PDTC組中藥組CD4+(%) 39.42±2.86 27.79±2.80△△22.35±2.72*32.22±2.89*29.86±3.07 30.18±3.05 31.43±2.92*CD8+(%) 20.49±2.63 31.73±3.30 34.12±3.93 26.73±2.53 31.40±2.78 33.26±3.18 29.29±1.46 CD4+/CD8+1.94±0.13 0.88±0.11△△0.67±0.08*1.22±0.06*0.96±0.10 0.90±0.08 1.08±0.11*CD4+凋亡率(%) 4.00±0.48 21.58±2.72△△43.47±5.17*13.38±1.14*20.15±2.38 18.56±1.86 15.47±1.35*

2.5 病理學(xué)檢查 SAP模型組大鼠胰腺出現(xiàn)大片出血、凝固性壞死和脂肪壞死，壞死區(qū)大量中性粒細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn)；肺泡壁明顯增厚，部分肺泡腔萎陷，肺間質(zhì)充血水腫，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)漿液性滲出；肝細(xì)胞呈片狀壞死，匯管區(qū)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡、濁腫、水樣變性，病理結(jié)果符合急性出血壞死性胰腺炎致MODS表現(xiàn)。各治療組大鼠各臟器病理表現(xiàn)較之有不同程度的改善。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠胰腺病理評(píng)分比較

表4 各組大鼠胰腺病理評(píng)分比較

注：與SAP模型組相比,*P＜0.05,**P＜0.01

組別SAP模型組地塞米松組烏司他丁組善寧組PDTC組中藥組水腫3.67±0.52 2.54±0.69*2.18±0.98**2.38±0.92**2.24±0.87**2.09±0.94**炎癥3.00±0.63 1.71±0.76**1.45±0.93**2.00±0.76*1.33±0.64**1.55±0.69**出血1.67±0.82 1.57±0.79 0.82±0.60*0.88±0.64*0.96±0.52*1.00±0.63壞死3.00±0.89 2.29±0.76 1.00±0.78**1.50±0.76**1.02±0.65**1.18±0.60**總分11.33±2.16 9.86±1.86 5.36±1.96**6.50±1.60**5.45±1.52**5.82±1.33**

3 討論

本研究中觀察的幾種急性胰腺炎臨床常用治療藥物，不同程度地在降低血清淀粉酶、減輕胰腺及胰外臟器病理?yè)p害等方面顯示出一定的治療作用，但對(duì)機(jī)體免疫功能的影響卻不盡相同。

傳統(tǒng)的糖皮質(zhì)激素治療確實(shí)可在一定程度上緩解SAP的病情，但另一方面也加劇了病程中的免疫抑制。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，地塞米松可通過(guò)誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞凋亡進(jìn)一步增加，加劇SAP大鼠T細(xì)胞亞群比例失調(diào)及細(xì)胞免疫功能障礙。此外，地塞米松能夠明顯降低血清TNF-α和IL-6水平，IL-10水平反而有升高趨勢(shì)，其對(duì)促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子的選擇性作用，使免疫平衡更加向抗炎反應(yīng)方向傾斜，而過(guò)度的抗炎反應(yīng)勢(shì)必加重SAP免疫抑制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，糖皮質(zhì)激素在減輕炎癥反應(yīng)的同時(shí)，可能加劇免疫功能抑制，以至發(fā)生繼發(fā)感染、膿毒血癥甚至MODS的危險(xiǎn)，如何權(quán)衡在SAP的臨床治療中的利弊有待進(jìn)一步研究。

善寧是人工合成的一種生長(zhǎng)抑素類(lèi)似物，實(shí)驗(yàn)顯示，善寧在抑制胰腺分泌、降低血清淀粉酶方面的作用優(yōu)于其它治療組，同時(shí)也具有一定的抑制促炎細(xì)胞因子分泌的作用，但對(duì)T細(xì)胞免疫功能無(wú)明顯影響，在減輕臟器病理?yè)p害和減少病死率方面也沒(méi)有顯示出明顯優(yōu)勢(shì)。

烏司他丁是一種廣譜的酶抑制劑，目前已成為急性胰腺炎臨床治療的重要選擇，實(shí)驗(yàn)中也顯示出良好的治療效果。此外，烏司他丁對(duì)免疫功能亦具有一定的調(diào)節(jié)作用，一方面可通過(guò)減少CD4+T細(xì)胞的異常凋亡改善T淋巴細(xì)胞亞群比例失調(diào)及細(xì)胞免疫功能障礙，另一方面可以同時(shí)抑制促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，使SAP時(shí)機(jī)體的免疫紊亂趨于緩和。

NF-кB是一種具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核蛋白，可啟動(dòng)諸多細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，在SAP發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。PDTC是一種NF-кB活性阻斷劑，可通過(guò)不同方式拮抗NF-кB的活性。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PDTC可明顯降低血清促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6水平，緩解過(guò)度的炎癥反應(yīng)，減輕胰腺組織病理?yè)p害，但對(duì)IL-10水平無(wú)明顯影響，提示IL-10的分泌可能存在NF-кB以外的其他調(diào)控途徑。

萊菔承氣湯是我院中西醫(yī)結(jié)合治療SAP常用藥物，取得較好的臨床療效。研究證實(shí)萊菔承氣湯可減少SAP死亡率和多臟器病理?yè)p害。其對(duì)SAP免疫紊亂多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的綜合調(diào)控作用表現(xiàn)為有效降低血漿內(nèi)毒素水平，減少CD4+T細(xì)胞的異常凋亡，改善細(xì)胞免疫功能，抑制促炎及抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，使機(jī)體過(guò)度的抗炎和促炎反應(yīng)恢復(fù)為一種低水平的平衡態(tài)，減輕機(jī)體免疫損傷，有助于緩解可能發(fā)生的SIRS和CARS，減少M(fèi)ODS和嚴(yán)重感染的發(fā)生率。萊菔承氣湯在SAP綜合治療中對(duì)機(jī)體免疫平衡調(diào)節(jié)的影響，有待進(jìn)一步研究。

[1]寇麗,王春立,尤勝義.重癥急性胰腺炎大鼠脾臟巨噬細(xì)胞Toll樣受體4的表達(dá)及分泌細(xì)胞因子水平的變化[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2007,24（4）:404.

[2]許永春,李兆申,屠振興,等.單核細(xì)胞趨化蛋白在重癥急性胰腺炎發(fā)病機(jī)制中的作用[J].胰腺病學(xué),2004,4（2）:94.

（收稿：2009-10-08）

（責(zé)任編輯 瞿 全 崔乃強(qiáng)）

Effect of Different Drugs on Immune Function of Rats in Severe Acute Pancreatitis

You Shengyi,Kou Li, Wang Chunli,et al. Tianjin General Hospital,Tianjin(300052),China

Objective To observe the different effects of drugs on immune function in SAP.Methods SAP-MODS model in rats was established,then treated with dexamethasone(DXM),ulinastatin,octreotide, PDTC or LaiFuChengQiTAng(LFCQ)respectively.The blood levels of amylase,endotoxin and cytokines including TNF-α,IL-6 and IL-10 were measured after 24 h.T lymphocyte subsets of the spleen with their apoptotic rate were measured by Flow Cytometry.Pathologic changes of the pancreas,liver,lung and kidney were also detected.Results DXM decreased the levels of TNF-α and IL-6.At the same time,the abnormal apoptosis rate of CD4+T lymphocytes increased all the more,leading to deeper immune disorder.Octreotide and PDTC could decrease TNF-αand IL-6 but no effects on T lymphocyte function.Ulinastatin and LFCQ decreased the levels of inflammatory cytokines(TNF-αand IL-6)and anti-inflammatory cytokine(IL-10)simultaneously; and the abnormal apoptosis rate of CD4+T lymphocytes decreased obviously,the mortality rate and pathologic injury reduced either.LFCQ showed the only effect on eliminating endotoxin.Conclusion DXM aggravates immune disorder in SAP,Ulinastatin and LFCQ are helpful in regulating the balance of inflammation and anti-inflammatory response and also improving immune function.

severe acute pancreatitis,immune function,T lymphocyte subsets,cytokine，medication

Q95-33;R657.5+1

A

1007-6948(2010)02-0192-03

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2006BAI04A15）

天津市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（043609511）

天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合外科（天津300052）