Wnt8a在小鼠胚胎心肌分化中的作用

高勝利 高淑紅 侯澤

Wnt信號(hào)通路對(duì)許多物種的胚胎心肌分化具有重要作用[1]。對(duì)Wnt8a在胚胎心肌細(xì)胞分化過程中的作用，存在兩種相反的觀點(diǎn)。一種觀點(diǎn)是Wnt8a抑制胚胎心肌分化[2]；另一種觀點(diǎn)是Wnt8a促進(jìn)胚胎心肌分化[3]。小鼠胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)在二甲基亞砜誘導(dǎo)(DMSO)下分化成心肌細(xì)胞，體外心肌細(xì)胞分化與體內(nèi)完整胚胎心肌發(fā)育過程相符，鑒于此，本文以DMSO作為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)ES細(xì)胞心肌分化，檢測(cè)分化過程中Wnt8a的表達(dá)和作用，研究其在胚胎心肌分化中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 ES細(xì)胞來源

來自于129純系小鼠胚胎干細(xì)胞系(ES-D3)，25～30代。

1.1.2 主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基，胎牛血清，二甲基亞砜，F(xiàn)rizzled-8/Fc Chimera，RNA提取試劑盒。引物設(shè)計(jì)見表1。

表1 引物設(shè)計(jì)

1.1.3 主要儀器

醫(yī)用凈化工作臺(tái)，CO2培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，凝膠成像系統(tǒng)，PCR儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ES細(xì)胞的復(fù)蘇培養(yǎng)

ES細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)飼養(yǎng)層上。將已培養(yǎng)2～3天生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞克隆，消化成單細(xì)胞懸液，以1：3～1：6傳代，培養(yǎng)基顏色變黃時(shí)半量換液。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)組：ES細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基加1%DMSO；對(duì)照組：ES細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基加1%DMSO和Frizzled-8/Fc(200ng/ml)。

1.2.3 細(xì)胞分化培養(yǎng)

將ES細(xì)胞消化吹打成單細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿懸浮培養(yǎng)4天形成擬胚體，吸取擬胚體，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中(做PCR)和36孔培養(yǎng)板中，每孔一個(gè)擬胚體，加入分化培養(yǎng)基。觀察分化細(xì)胞形態(tài)及是否出現(xiàn)自發(fā)性收縮，對(duì)比分化率。

1.2.4 Wnt8a mRNA檢測(cè)

從貼壁培養(yǎng)第1天起，每日提取總RNA，RT-PCR檢測(cè)分化過程中Wnt8a mRNA的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包11.5對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)均用(±s)表示，采用student t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

表2 不同誘導(dǎo)劑對(duì)胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的影響

圖1 分化第2，3，4天Wnt8a(400bp)的表達(dá)

2.1 ES細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞

ES細(xì)胞貼壁培養(yǎng)第2天起，兩組均可見自發(fā)節(jié)律性收縮的心肌樣細(xì)胞，收縮頻率45～75次/分，持續(xù)10天。實(shí)驗(yàn)組分化率為92.22%，對(duì)照組分化率為37.78%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.2 Wnt8a在分化過程中的表達(dá)

兩組在分化第2、3、4天檢測(cè)到Wnt8a表達(dá)，第5天后未檢測(cè)到表達(dá)。

3 討論

研究表明Wnt8a抑制胚胎心肌發(fā)育，Wnt8a在蛙類、雞、小鼠胚胎中臨近心前區(qū)的組織中分泌，心肌的形成取決于Wnt3a和Wnt8a的抑制。將Wnt8 cDNA注射到雞胚4細(xì)胞期的2背分裂球，并培養(yǎng)至23或30期，抑制心肌特異因子nkx-2.5的表達(dá)[2]。也有研究認(rèn)為Wnt8a促進(jìn)胚胎心肌發(fā)育，用產(chǎn)生Wnt8a病毒感染雞胚的側(cè)中胚層，心肌特異基因的表達(dá)未受到影響，未抑制正常心肌分化[3]。

二甲基亞砜能誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞，1%DMSO誘導(dǎo)效應(yīng)最高，分化率達(dá)到96.7%[4]。兩組誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)ES細(xì)胞，可見自動(dòng)節(jié)律性收縮細(xì)胞，分化為心肌樣細(xì)胞，分化過程Wnt8a表達(dá)陽(yáng)性。對(duì)照組加入了Frizzled-8/Fc，F(xiàn)rizzled-8/Fc與Wnt受體Frz結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性抑制Wnt8a與Frz結(jié)合，阻斷Wnt8a作用途徑[5]，盡管對(duì)照組Wnt8a表達(dá)陽(yáng)性，但分化率下降，說明了Frizzled-8/Fc抑制了Wnt3a可促進(jìn)在ES細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞的作用。由此推斷，Wnt8a促進(jìn)小鼠胚胎心肌分化。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，Wnt8a在分化開始第2，3，4天表達(dá)，在第5天后未能檢測(cè)到，提示W(wǎng)nt8a對(duì)胚胎心肌分化的作用依賴于分化的時(shí)期，僅僅在分化早期具有促進(jìn)作用。隨著研究的不斷深入，對(duì)于Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在心肌分化和心臟形成的作用，將有更清晰的認(rèn)識(shí)，有助于了解胚胎心肌分化和心臟發(fā)育機(jī)制。

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[3]Leonard M,Eisenberg.Eisenberg Evaluating the Role of Wnt Signal Transduction in Promoting the Development of the Heart[J].The Scientific World,2007,7:161-176.

[4]王秀麗,虞星炬.二甲基亞砜誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化伴隨凋亡現(xiàn)象的研究[J].解剖學(xué)雜志,2005,28(06):609-614.

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