原花青素脂質(zhì)體的制備條件優(yōu)化

胡 博，姚薇薇，劉 寧

（乳品科學教育部重點實驗室，東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，哈爾濱 150030）

原花青素（Procyanidins，PC，曾用英文名Proanthocyanidins，Pycnogenol）是一大類多酚化合物的總稱，由不同數(shù)目的黃烷-3-醇或黃烷-3，4-二醇聚合而成。按聚合度大小，二至四聚體稱為低聚原花青素（Oligomeric proanthocyanidins，OPCs），五聚體以上稱為多聚原花青素（Polymers procyanidins，PPCs）[1-2]。近代研究發(fā)現(xiàn)，原花青素具有極強的清除自由基能力和顯著的抗高血壓[3－4]、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤防癌等生理功能，其清除自由基的能力是VC的20倍、VE的50倍[5－6]，以安全低毒、高效、高生物利用率而著稱[7]，其在食品添加劑、保健品、藥物和化妝品等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。由此可見，對原花青素進行研究，有利于更好地利用該寶貴資源。

原花青素的水溶性較好[8]，但穩(wěn)定性較差，易受外界條件影響[9]，如易氧化，對光、熱、pH值敏感等[10-11]，這使其應(yīng)用受到限制。因此，必須對它進行保護。目前研究較多的是原花青素微膠囊，并且已經(jīng)進行了工業(yè)化生產(chǎn)，但是其粒徑較大，不利于人體吸收，如何在有效保護原花青素的同時減小其粒徑一直是個難題。采用脂質(zhì)體包埋可以解決這一難題[12]，脂質(zhì)體粒徑小，具有靶向性，有利于吸收，制備工藝簡單，具有廣泛的應(yīng)用前景。制備脂質(zhì)體的方法很多，其中逆相蒸發(fā)法制備的大單層脂質(zhì)體具有較大的水性空間，更適合對水溶性物質(zhì)的包埋[13]。任文霞等在進行茶多酚脂質(zhì)體制備方法的篩選時，發(fā)現(xiàn)逆相蒸發(fā)法制備的茶多酚脂質(zhì)體包埋率較高，可達48.9%[14]。周威比較了在相同條件下應(yīng)用逆相蒸發(fā)法和其他方法制備了溶菌酶脂質(zhì)體，經(jīng)過研究他發(fā)現(xiàn)逆相蒸發(fā)法的包埋率最高，適用于工業(yè)生產(chǎn)[15]。

本試驗以大豆卵磷脂、膽固醇為膜材，采用逆相蒸發(fā)法制備原花青素脂質(zhì)體。以脂質(zhì)體包埋的形式來增強原花青素的穩(wěn)定性，通過試驗研究，對原花青素脂質(zhì)體的制備條件進行了優(yōu)化。

1.3 方法

1 材料與方法

1.1 試劑

原花青素，純度為95%（購自山東臨沂泰豪國際貿(mào)易有限公司）；大豆卵磷脂（購自上海源聚生物科技有限公司）；膽固醇（購自天津市博迪化工有限公司）；無水乙醇、正丁醇、鹽酸及其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

ZFQ85B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（購自上海醫(yī)械專機廠）；KQ32000DB型數(shù)控超聲波清洗器（購自上海昆山超聲儀器有限公司）；SYNERGY超純水儀（購自美國Millipore公司）；AL204精密電子天平（購自瑞士梅特勒-托利多公司）；UV-2401PC紫外可見分光光度計（購自日本島津公司）；DelsaNano C型粒度分析儀（購自美國貝克曼庫爾特有限公司），DelsaNano C型Zeta電位分析儀（購自美國貝克曼庫爾特有限公司）；透射電子顯微鏡（購自日本日立H-7650）。

1.3.1 逆相蒸發(fā)法制備空白脂質(zhì)體

取總量為0.4 g，一定比例的大豆卵磷脂、膽固醇置于梨形燒瓶中，加入體積比為1：1的乙醚和乙醇溶解，振搖，再加入一定濃度的2 mL磷酸緩沖液，震蕩混合均勻，超聲5 min，旋轉(zhuǎn)至干成膜，加入磷酸緩沖溶液，使膜溶解并充分水合，將所得粗混懸液過0.45 μm濾膜，得到空白脂質(zhì)體。

1.3.2 逆相蒸發(fā)法制備原花青素脂質(zhì)體

取總量為0.4 g，一定比例的大豆卵磷脂、膽固醇置于梨形燒瓶中，加入體積比為1：1的乙醚和乙醇溶解，振搖，再加入一定濃度的2 mL磷酸緩沖原花青素溶液，震蕩混合均勻，超聲5 min，旋轉(zhuǎn)至干成膜，加入磷酸緩沖溶液，使膜溶解并充分水合，將所得粗混懸液過0.45 μm濾膜，得到原花青素脂質(zhì)體混懸液。

1.3.3 原花青素的測定

取不同濃度原花青素對照品的樣液0.5 mL，加入到20 mL的具塞試管中，然后加入5 mL正丁醇-鹽酸（體積比95：5）溶液，搖勻。打開塞子放入97℃恒溫水浴中，3 min后塞緊塞子，加熱40 min后，打開塞子，冷卻5 min。于546 nm處測定吸光值，繪制標準曲線。

1.3.4 原花青素脂質(zhì)體包埋率的測定

總原花青素含量：取等量原花青素脂質(zhì)體和空白脂質(zhì)體于試管中，加入適量無水乙醇破乳，15 000 r·min-1離心30 min，取上清液，定容至25 mL，以離心后的空白脂質(zhì)體作對照，用正丁醇-鹽酸法測定制備樣品中總原花青素的含量。

游離的原花青素含量：吸取等量原花青素脂質(zhì)體和空白脂質(zhì)體于離心管中，15 000 r·min-1離心30 min，取上清液，定容至25 mL，以離心后的空白脂質(zhì)體作對照，用正丁醇-鹽酸法測定制備樣品中游離原花青素的含量。

包埋率計算公式為：包埋率（%）=（添加原花青素總含量＋游離原花青素的量）/添加原花青素總量×100%

1.3.5 脂質(zhì)體顯微形態(tài)觀察

將脂質(zhì)體混懸液在透射電子顯微鏡下進行觀察。透射電子顯微鏡采用磷鎢酸負染法進行，即將脂質(zhì)體稀釋一定倍數(shù)后滴至專用銅網(wǎng)上，靜止吸附3 min，用濾紙吸干銅篩邊緣多余的液體樣品，然后放在一滴用2.0%磷鎢酸溶液上進行復(fù)染，用濾紙吸干銅篩邊緣多余的染色液，自然晾干后放入透射電子顯微鏡下進行觀察。

1.3.6 脂質(zhì)體粒徑的測定

依次取適量的脂質(zhì)體混懸液，用DelsaNano C粒度分析儀測定原花青素脂質(zhì)體的粒徑。每個樣品重復(fù)運行3次取平均值。

1.3.7 脂質(zhì)體Zeta電位的測定

依次取適量的脂質(zhì)體混懸液放入樣品池中，用DelsaNano C電位儀測定脂質(zhì)體的電位。每個樣品測定3次取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

圖1為原花青素不同濃度組成標準曲線。由圖可知，在測定范圍內(nèi)，原花青素的濃度與吸光值有良好的線性關(guān)系，線性方程為y=1.4011x-0.0076，以此標準曲線計算原花青素脂質(zhì)體的包埋率。

圖1 原花青素濃度標準曲線Fig.1 Standard curve of procyanidine concentration

2.2 膽固醇與卵磷脂的不同比例對包埋率的影響

膽固醇與卵磷脂是脂質(zhì)體形成不可缺少的膜材，二者比例是影響脂質(zhì)體包埋率的主要因素。卵磷脂是脂質(zhì)體的主要膜材，加入膽固醇可以改變其相變溫度，對脂質(zhì)膜的流動性產(chǎn)生雙向調(diào)節(jié)功能。根據(jù)國內(nèi)外已有文獻及預(yù)實驗結(jié)果，膽固醇與卵磷脂物質(zhì)的量比在1：1～1：5包埋率較高。在一定的比例范圍內(nèi)，如果膽固醇的比例過大，組成脂質(zhì)體的卵磷脂添加量太少，脂質(zhì)體膜的形成就會困難，而且不牢固，而由此形成的脂質(zhì)體膜親水性太強，膜也容易破壞。固定其他組分的比例不變，僅改變膽固醇和卵磷脂的比例，制備原花青素脂質(zhì)體，包埋率隨兩者比例的變化情況見圖2。

圖2 膽固醇與卵磷脂比對包埋率的影響Fig.2 Effect of the ratio of cholesterol to lecithin on entrapment efficiency of procyanidine liposomes

由圖2可知，隨著卵磷脂的增加，原花青素脂質(zhì)體的包埋率先增加后減小。當膽固醇與卵磷脂摩爾為1：2時，原花青素脂質(zhì)體包埋率最高，為80.5%±3.4%。

2.3 原花青素添加量對包埋率的影響

水溶性藥物被包埋于內(nèi)核水相中，經(jīng)常在脂質(zhì)體水相和油相間重新分配，容易引起藥物的泄露，所以原花青素的添加量直接影響脂質(zhì)體的包埋率。選擇原花青素與卵磷脂的不同比例，根據(jù)預(yù)實驗當其比例在1：10～1：50時包埋率較高。固定其他組分的比例不變，只改變原花青素與卵磷脂的比例，制備原花青素脂質(zhì)體，包埋率隨兩者比例的變化情況見圖3。

圖3 原花青素與卵磷脂比對包埋率的影響Fig.3 Effect of the ratio of procyanidine to lecithin on entrapment efficiency of procyanidine liposomes

由圖3可知，隨著卵磷脂的增加，脂質(zhì)體的包埋率升高，但藥脂比大于1：40后，包埋率開始降低。當藥脂比為1：40時，包埋率達到最高值。

2.4 水溶液與有機溶劑不同比例對包埋率的影響

通過逆相蒸發(fā)法可以得到大單層脂質(zhì)體，脂質(zhì)體有較大的水性空間，所以選擇適當?shù)乃芤号c有機溶劑體積比可使內(nèi)相體積增加，通常選擇在1：2～1：6范圍內(nèi)。固定其他組分的比例不變，改變水溶液與有機溶劑比例，制備原花青素脂質(zhì)體，包埋率隨兩者比例的變化情況見圖4。

圖4 水溶液與有機溶劑比對包埋率的影響Fig.4 Effect of the ratio of water to organic solvent on entrapment efficiency of procyanidine liposomes

由圖4可知，當比例為1：3時，包埋率最高。在制備過程中，水溶液與有機溶劑的比例影響脂質(zhì)材料的溶解度，從而影響脂質(zhì)體的包埋率。

2.5 溫度對包埋率的影響

制備過程中，水浴溫度高時脂質(zhì)的成膜速度快，卵磷脂和膽固醇間不易形成致密結(jié)合，且原花青素對熱不穩(wěn)定，因此成膜時水浴溫度不宜超過50℃。制備原花青素脂質(zhì)體，固定其他組分的比例不變，僅改變水浴的溫度，包埋率隨溫度的變化情況見圖5。

圖5 溫度對包埋率的影響Fig.5 Effect of the temperature on entrapment efficiency

在制備過程中，溫度對包埋率有較大影響，溫度過高時，脂質(zhì)體流動性變大，膜內(nèi)包封的物質(zhì)易于泄露；而溫度過低時，有機溶劑的揮發(fā)速度變慢，影響脂質(zhì)體的形成。由圖5可知，35℃時原花青素脂質(zhì)體的包埋率最高，而50℃時的包埋率較45℃時高，原因可能是原花青素的熱穩(wěn)定性差，導(dǎo)致其熱降解，故所得包埋率較高。

2.6 正交設(shè)計確定原花青素脂質(zhì)體配方

根據(jù)初步試驗分析，影響原花青素脂質(zhì)體包埋率的主要因素有膽固醇與卵磷脂物質(zhì)的量比、原花青素與卵磷脂質(zhì)量比、水溶液與有機溶劑體積比、溫度。因此用L9（34）正交試驗設(shè)計法進行試驗，確定原花青素脂質(zhì)體的配方比例。

表1 正交試驗設(shè)計Table 1 Orthogonal design

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，按照表1正交試驗設(shè)計確定的配方，以原花青素的包埋率為指標，確定最佳配方，結(jié)果見表2。

由表2的K值分析可以看出，4個因素對包埋率的影響順序為A＞B＞D＞C，即膽固醇與卵磷脂比＞原花青素與卵磷脂比＞溫度＞水溶液與有機溶劑比。該正交實驗的最優(yōu)工藝條件為A2B2C3D2，但是此條件所得出的包埋率不如試驗5的包埋率高。因此最佳工藝條件是A2B2C3D1，即膽固醇與卵磷脂的物質(zhì)的量比為1：2，原花青素與卵磷脂的質(zhì)量比為1：40，水溶液與有機溶劑比為1：4，溫度為30℃，以此工藝條件制備三次原花青素脂質(zhì)體，計算出包埋率的平均值為88.89%±2.5%。方差分析表明（見表3），在本試驗所選取的因素和水平下，膽固醇與卵磷脂比對包埋率有顯著影響，是影響脂質(zhì)體包埋率最主要的因素。

表2 原花青素脂質(zhì)體正交設(shè)計結(jié)果Table 2 Results of orthogonal design about procyanidine liposomes

表3 包埋率方差分析Table 3 Variance analysis for entrapment efficiency

2.7 脂質(zhì)體顯微形態(tài)觀察

對脂質(zhì)體進行負染色后，在透射電子顯微鏡下觀察脂質(zhì)體微觀結(jié)構(gòu)（見圖6），呈球狀或近似球狀的小囊泡，分布均勻且顆粒間彼此分散。

圖6 逆相蒸發(fā)法制備的原花青素脂質(zhì)體的復(fù)染色電鏡Fig.6 Electron microscope graph of procyanidine liposomes prepared by reverse evaporation

2.8 脂質(zhì)體粒徑的測定

經(jīng)DelsaNano C粒度分析儀測定原花青素脂質(zhì)體的粒徑，脂質(zhì)體的粒徑分布在185 nm～1.29 μm之間，平均粒徑為715.9 nm。

2.9 脂質(zhì)體Zeta電位的測定

經(jīng)DelsaNano C電位儀測定原花青素脂質(zhì)體的Zeta電位。一般情況下，Zeta電位的絕對值越大，說明膠體體系越穩(wěn)定，當電位＞60 mV時體系穩(wěn)定，電位30～60 mV時體系比較穩(wěn)定，電位＜30 mV時體系不穩(wěn)定。因此，Zeta電位是衡量膠體穩(wěn)定性的一個重要參數(shù)。測得的Zeta電位為37.04 mV，因此制備的原花青素脂質(zhì)體混懸液是比較穩(wěn)定的體系。

3 討論與結(jié)論

本研究在單因素試驗基礎(chǔ)上，經(jīng)正交設(shè)計試驗分析得出最佳工藝組合為A2B2C3D2，各因素對包埋率的影響順序為A＞B＞D＞C，即膽固醇與卵磷脂比＞原花青素與卵磷脂比＞溫度＞水溶液與有機溶劑比，但在此條件下所得出的包埋率較A2B2C3D1所得到的結(jié)果低，分析其原因，可能是水浴溫度高時脂質(zhì)的成膜速度快，卵磷脂和膽固醇間不易形成致密結(jié)合，從而影響脂質(zhì)體的包埋率。考慮到本試驗的目的是制備包埋率高的原花青素脂質(zhì)體，故確定處方工藝組合為A2B2C3D1，即膽固醇與卵磷脂的物質(zhì)的量比為1：2、原花青素與卵磷脂的質(zhì)量比為1：40、水溶液與有機溶劑比為1：4、溫度為30℃。在此條件下，原花青素脂質(zhì)體的包埋率為88.89%±2.5%。

脂質(zhì)體的包埋體積和脂質(zhì)體的粒徑呈線性關(guān)系，主要取決于包埋的水相體積[16]。粒徑越小包埋的水相體積越小，會降低脂質(zhì)體的包埋率。本研究中制備的脂質(zhì)體為大單室脂質(zhì)體，其具有較大的水相容積，平均粒徑為715.9 nm，包埋率較高。Zeta電位測定表明原花青素脂質(zhì)體電位處于30～60 mV之間，是比較穩(wěn)定的體系。此種制備方法操作方便、設(shè)備簡單，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

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