抗乙型腦炎病毒E蛋白單克隆抗體5D4重鏈可變區(qū)基因的克隆及序列分析

趙付榮,杜 鵑,王 斌,陳娜莎,華榮虹,步志高

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150001;2.華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院,廣東 廣州 510642;3.黑龍江大學生命科學學院,黑龍江 哈爾濱 150020)

流行性乙型腦炎(JE)簡稱乙腦,是由乙型腦炎病毒引起的一種重要蚊媒性人獸共患傳染病。多種動物易感,蚊是JEV的主要傳播媒介,豬是該病毒在自然界中最重要的貯存與增殖宿主,母豬感染可引起繁殖障礙,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。JEV主要在亞洲流行,而最近發(fā)現(xiàn)在南半球也有報道,這說明流行性乙型腦炎可能在世界范圍內(nèi)威脅著人類健康[1]。

JEV屬黃病毒科黃病毒屬,為單股正鏈、有囊膜的RNA病毒。病毒粒子包含3種結(jié)構蛋白(C、prM/M、E)。其中表面囊膜蛋白E蛋白是該病毒表面的一種重要的結(jié)構蛋白,在介導病毒的吸附、融合,決定病毒的血凝活性、細胞趨向性、病毒毒力和誘導宿主保護性免疫反應中起重要作用。

對乙型腦炎無特效治療方法,接種疫苗是控制該病流行的有效措施。但是感染發(fā)病后再注射疫苗時,因抗體產(chǎn)生較慢,嚴重患者影響治療效果,主張在注射疫苗的同時注射抗乙腦病毒免疫血清或單克隆抗體。但目前所能獲得的上述制劑均來自動物,進入人體后易引起過敏反應[2],而人的制劑又相當難獲得。本實驗室在通過原核表達JEV E蛋白的基礎上,制備了抗乙腦病毒 E蛋白的單克隆抗體5D4,通過一系列鑒定,能夠特異性的識別JEV E蛋白[3]。本試驗采用基因工程技術,從分泌抗JEV E蛋白的雜交瘤細胞中提取RNA,通過RT-PCR擴增抗體重鏈可變區(qū)基因VH,經(jīng)克隆及測序分析VH基因,旨在為構建抗JEV基因工程抗體奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、質(zhì)粒及菌株 分泌抗JEV抗體的雜交瘤細胞株5D4,大腸桿菌(E.coli)JM109菌株由獸醫(yī)生物技術重點實驗室保存。質(zhì)粒pMD18-T Vector為TaKaPa公司產(chǎn)品,

1.2 主要試劑 Trizol試劑為Gibco公司產(chǎn)品,AMV 反轉(zhuǎn)錄酶、rRNasin Ribonuclease Inhibitor、為Promega公司產(chǎn)品,Taq DNA聚合酶、Ligation SolutionⅠ為TaKaRa公司產(chǎn)品,質(zhì)粒抽提試劑盒為華舜生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 雜交瘤細胞總RNA的提取 從液氮罐中取出凍存的單抗雜交瘤細胞株5D4,復蘇后用含20%犢牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)至細胞總數(shù)約為2×107。1000 r/min離心10 min后,收集細胞,重懸沉淀于250μL pH 值7.2的無菌PBS中,并按RNA提取試劑盒(QIAGEN)提供的方法提取細胞總RNA,-20℃保存或直接用于反轉(zhuǎn)錄。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈 按照AMV反轉(zhuǎn)錄酶說明書進行反轉(zhuǎn)錄:細胞 RNA提取液20μL,rRNasin Ribonuclease Inhibitor 2μL,dNTP(10 mmol/μ L)4μL,下游引物(50pmol/μ L)2μL,5×AMV 酶緩沖液8μL,AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 4μL混勻后,室溫放置10 min后移入42℃恒溫槽中,水浴1 h取出,在冰上冰浴2 min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以直接進行PCR反應或-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 VH基因的擴增 根據(jù)抗體可變區(qū)基因序列的保守性,合成了針對重鏈可變區(qū)的通用引物[13-14],引物序列為:VHFor:5′-SAGGTSCAGCTGMAGGAGTCWGG-3′,VHBack:5′-TGAGGAGACGGTGACCATGGTCCC-3′[注:W=A/T;S=G/C;M=A/C;R=A/G]。以合成的cDNA為模板進行PCR擴增,反應條件:95℃5 min,94℃1 min,53℃1 min,72℃2.5 min,循環(huán)35次,72℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物以回收試劑盒回收。

1.3.4 VH基因的克隆 將回收的VH基因與T載體連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,37℃培養(yǎng)過夜,隨機挑取生長良好的單個菌落進行PCR鑒定。陽性克隆進行序列測定。

1.3.5 克隆的VH和VL基因序列分析 測得的基因序列,在NCBI網(wǎng)站上用BLAST程序進行檢索,與獲得的抗體VH基因序列進行同源性分析,V區(qū)基因的胚系分析可通過登錄英國的生物信息學研究所的站點(http://www.ebi.ac.uk/imgt/),進入IMGT/V-QUEST網(wǎng)頁,將VH基因序列輸入對話框進行胚系基因片段的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 5D4的VH和VL基因的擴增及鑒定 分別用輕、重鏈特異性5′端和 3′端引物,對重鏈可變區(qū)基因進行PCR擴增。各取PCR產(chǎn)物5μL,以1.5%Agarose凝膠電泳,顯示330 bp位置可見清晰的特異性擴增VH 條帶(圖1)。

2.2 5D4的VH在pMD18-T Vector質(zhì)粒的克隆與鑒定 以pMD18-T-VH表示插入了5D4 VH重組質(zhì)粒。以5D4 pMD18-T-VH的連接產(chǎn)物,轉(zhuǎn)化E.coli JM109,在含Amp+的LB平板上培養(yǎng),分別從中隨機挑取單克隆進行培養(yǎng),提取質(zhì)粒DNA得到重組質(zhì)粒5D4pMD18-T-VH通過提質(zhì)粒進行PCR鑒定。得到330 bp左右的VH片段(圖2),表明5D4的VH基因在質(zhì)粒中克隆成功。

2.3 5D4的VH和VL核苷酸序列的測定及分析通過BLAST在GenBank數(shù)據(jù)庫中對獲得的抗體VH基因序列進行同源性分析,結(jié)果顯示基因與序列 號 AY853694(gi:57169132)、AY208318(gi:37784217)同源性達94%,通過英國的生物信息學研究所在線程序進行胚系基因片段的分析,經(jīng)分析為小鼠免疫球蛋白基因,其VH屬于IgHVⅠ家族,D段無結(jié)果,J段來自IgHVⅡ家族。該抗體VH基因序列與對應的氨基酸序列如圖3所示。

3 討論

相關文獻表明,抗體可變區(qū)基因擴增的關鍵是雜交瘤細胞生長狀態(tài)與引物設計[4-5],由于擴增的抗體可變區(qū)基因是未知序列,所以引物的設計顯得尤為重要,首先考慮到引物的通用性,本文根據(jù)抗體可變區(qū)基因序列的保守性,合成了一對針對重鏈可變區(qū)的通用引物,試驗結(jié)果顯示,擴增到328 bp的重鏈可變區(qū)基因,經(jīng)序列測定后,發(fā)現(xiàn)該基因為小鼠免疫球蛋白基因。

與鼠源單克隆抗體比較基因工程抗體的具有操作簡便、表達量大、成本低廉的特點[6],用克隆的V區(qū)基因可產(chǎn)生與抗原特異性結(jié)合的抗體片段[7],利用基因突變技術改變抗體的某些結(jié)構可提高抗體的親和力,比如單鏈抗體,嵌合抗體等,可延長其半衰期[8]。隨著分子生物學和免疫學技術的不斷發(fā)展,基因工程抗體勢必將會對人類的生產(chǎn)、生活起到更大的促進作用。

本試驗通過RT-PCR技術成功擴增了抗JEV E蛋白單抗5D4重鏈可變區(qū)基因,并對該基因進行了序列分析,結(jié)果顯示,該基因與小鼠免疫球蛋白基因相符。我們正在開展5D4基因工程抗體的研究,該基因克隆與序列分析為此研究奠定了良好的基礎。

[1]van Den Hurk A F,Montgomery B L,Northill J A,et al.Short report:the first isolation of Japanese encephalitis virus from mosquitoes collected from mainland Australia[J].Am J T rop Med Hyg,2006,75(1):21-25.

[2]Larrick J W.Potential of monoclonal antibodies as pharmacological agents[J].Pharm Rev,1989,41:539-557.

[3]趙付榮,華榮虹,王斌,等.流行性乙型腦炎病毒E蛋白單克隆抗體的制備與鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志,2010,46(1):3-5.

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[5]Asano R,Takemura S,Tsumoto K,et al.Functional construction of the anti-mucin core protein(M UC1)antibody MUSE11 variable regions in a bacterial ex pression system[J].J Biochem,2000,127(4):673-679.

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[7]Benhar I,Pastan I.Identification of residues that stabilize the single-chain Fv of monoclonal antibodies B3[J].J Biol Chem,1995,270:23373-23380.

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