不同種屬參多糖對免疫及抗菌作用的影響

張 明

(菏澤學(xué)院生命科學(xué)系,山東 菏澤 274015)

山參為五加科植物人參的干燥根,含多種皂苷和多糖類成分,產(chǎn)于吉林長白山脈、遼寧、黑龍江、河北、山西;三七參為五加科人參屬植物的干燥根,具有顯著的活血化瘀、消腫定痛功效;西洋參為五加科植物西洋參的干燥根,產(chǎn)于吉林長白山脈、福建、云南等高海拔山區(qū),具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰,清熱生津。人參的研究主要集中在成分分離及藥理和性質(zhì)上[1-3],而對于其免疫和抑菌效果鮮有報(bào)道[4-6]。本試驗(yàn)對不同種屬參多糖進(jìn)行比較研究,旨在為不同種屬參多糖中草藥的開發(fā)和利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人參:分別來源于云南大理的三七參,吉林長白山的西洋參,吉林長白山山參;小鼠購于菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,常規(guī)飼養(yǎng);雞購于菏澤市大和養(yǎng)雞場;金黃色葡萄糖菌、大腸桿菌和鏈球菌來源于本系微生物培養(yǎng)室。

1.2 儀器和試劑 DG-3022型酶聯(lián)免疫檢測儀,國營華東電子管廠產(chǎn)品;CO2培養(yǎng)箱,美國 Reveo公司生產(chǎn);75-2A型微量振蕩器,上海醫(yī)用分析儀器廠生產(chǎn);恒溫培養(yǎng)箱,天津市津北真空儀器廠;倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)(Olympus IX-50),重慶光學(xué)儀器廠生產(chǎn);721紫外分光光度計(jì),上海第二儀器廠;DMEM培養(yǎng)基,Gibco公司產(chǎn)品;伴刀豆素球蛋白(ConA),Sigma公司產(chǎn)品;血清脂肪酶(LPS),Sigma公司產(chǎn)品;四甲基偶氮唑藍(lán)(MT T),Amresco公司產(chǎn)品;淋巴細(xì)胞分離液;裂解液:二甲基亞砜(DMSO)分析純,蘇州正興化工研究院產(chǎn)品。

1.3 人參多糖的提取 人參用水沖洗干凈,烘干粉碎成粗粉,乙醚脫脂回流,烘干,脫脂人參干粉分別稱5 g,按1∶20料液比,溫度為100℃,索式提取器回流提取2次,合并濾液,減壓濃縮,80%乙醇終濃度(V/V)沉淀24 h,3000 r/min離心,烘干,稱量定容,硫酸苯酚法測吸光度(y=1.546x-0.1444 R2=0.9946),計(jì)算粗多糖含量及多糖率[多糖含量(%)=(C樣×250×10-3)/W樣×100%;其中:C樣表示標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的樣品濃度W樣表示稱取的粗多糖樣品質(zhì)量多糖提取率(%)=(粗多糖提取物總質(zhì)量×樣品多糖含量)/板藍(lán)根粉質(zhì)量]。

1.4 巨噬細(xì)胞的吞噬試驗(yàn) 取小鼠20只,雌雄各半,隨機(jī)分為4組:試驗(yàn)組Ⅰ(三七參多糖)、試驗(yàn)組Ⅱ(山參多糖)、試驗(yàn)組Ⅲ(西洋參多糖)、試驗(yàn)組Ⅳ(生理鹽水),其中Ⅳ為對照組,每天對Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分別腹腔注射0.5mL濃度為2 mg/mL多糖溶液,連續(xù)免疫7 d,對照組則注射等量生理鹽水。第8天,腹腔注射1mL 2%雞細(xì)胞懸液,30 min后頸椎處死小鼠,無菌注射2mL生理鹽水到腹腔中揉勻5 min后取腹腔液,調(diào)細(xì)胞濃度為 2×105/mL,取300μL于載玻片上置濕盒內(nèi)37℃培養(yǎng)箱中貼附30 min,取出后用37℃預(yù)熱的PBS沖洗未被吞噬的雞紅細(xì)胞,立即置甲醇溶液中固定3 min,姬姆薩染液染色20 min,晾干觀察,計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)。

1.5 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 取3只小鼠頸椎處死,無菌取脾臟,用滅菌生理鹽水沖洗3次,放入含 Hank′s液的平皿中剪碎。裝入100目網(wǎng)孔的尼龍網(wǎng)袋中。用彎針頭擠壓過濾收集細(xì)胞液,加入淋巴細(xì)胞分離液,2000 r/min離心20 min,吸取中間云霧狀白細(xì)胞層。用Hank′s液洗2次。用DMEM 營養(yǎng)液稀釋成1×106/mL的細(xì)胞懸液,分別向細(xì)胞懸液中加入ConA和LPS(終濃度為5μg/mL),然后加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔 100μL,再分別加入不同地區(qū)人參多糖 100μL,每種濃度重復(fù)4孔。另設(shè)ConA和LPS的對照孔,細(xì)胞調(diào)零孔。將細(xì)胞板放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h。每孔中加入20μL MTT液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h取出,各孔吸出上清液,加入100μL裂解液,在微量震蕩器上混勻使其顏色變澄清,用酶聯(lián)免疫儀檢測570 nm下的吸光度作為淋巴細(xì)胞增殖的指標(biāo)(OD570 nm)。

1.6 最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)的檢測

1.6.1 最低抑菌濃度(MIC)檢測 按試管2倍稀釋法進(jìn)行,取7支高壓滅菌試管,各管分別加入營養(yǎng)肉湯1mL,在第1管中加入試驗(yàn)試劑1mL,混勻后吸取1mL加入到第2管中,第2管按同樣方法混勻后吸取1mL加入到第3管,依次稀釋至第6管,第6管混勻后棄去1mL,第7管不加藥液作對照。各管分別加入用生理鹽水稀釋成含菌量為108CFU/mL的試驗(yàn)菌液,混勻,37℃培養(yǎng) 24 h,搖勻,將各管中的液體用接種環(huán)接種于平板培養(yǎng)基中,輕輕將菌液攤開,37℃培養(yǎng)20 h,觀察結(jié)果。每株受試菌株進(jìn)行2次重復(fù)試驗(yàn)。平板上明顯有細(xì)菌生長而出現(xiàn)菌落的判斷細(xì)菌生長陽性,無菌落者判斷細(xì)菌生長陰性。以抑制細(xì)菌生長的藥物最低濃度為MIC。

1.6.2 最低殺菌濃度(MBC)的檢測 測出MIC后,在依次從未見細(xì)菌生長的各試管培養(yǎng)物中分別吸取0.1mL,接種于不含藥的平皿瓊脂培養(yǎng)皿中,輕輕攤開菌液,37℃培養(yǎng)24 h,觀察結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)為生長菌落數(shù)小于5的藥液最低濃度為MBC。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種屬人參多糖對小鼠吞噬功能的影響。見表1。

表1 小鼠腹腔吞噬細(xì)胞的吞噬百分率和吞噬指數(shù)(D)

表1 小鼠腹腔吞噬細(xì)胞的吞噬百分率和吞噬指數(shù)(D)

注:同一列不同小寫字母表示差異顯著(P＜0.05)

從表1可以看出,不同種屬的人參多糖與對照相比吞噬百分率和吞噬指數(shù)差異均達(dá)到顯著水平(P＜0.05),不同種屬的人參多糖之間有一定差異,西洋參多糖吞噬百分率顯著高于三七參多糖和紅參多糖,而三七參多糖和山參多糖之間差異不顯著,對于吞噬指數(shù)各多糖差異不顯著。

2.2 不同種屬人參多糖對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增值的影響。見表2。

表2 不同種屬參多糖對體外小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增值的影響(OD570 nm,n=3)

由表2可知,與對照組相比較,除山參多糖+LPS外,其他多糖和ConA或LPS相互作用對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖均達(dá)到顯著水平(P＜0.05),西洋參多糖協(xié)同促進(jìn)作用明顯,而單獨(dú)人參多糖之間淋巴細(xì)胞增殖無顯著差異,說明人參多糖不能對小鼠淋巴細(xì)胞產(chǎn)生直接促進(jìn)作用。

2.3 不同種屬人參多糖最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)。見表3,表4。

表3 3種參多糖對4種細(xì)菌的最低抑菌濃度(MIC)(g/mL)

3種不同種屬的人參多糖對支原體、鏈球菌、大腸桿菌及金黃色葡萄球菌均有一定的抑制作用。其中三七參和山參多糖對金黃色葡萄球菌和支原體的抑制作用較強(qiáng),MIC均為0.125 g/mL;對大腸桿菌和鏈球菌,藥物濃度為0.250 g/mL時(shí)有部分抑制作用,其MIC均為0.500 g/mL.西洋參多糖濃度為0.125 g/mL時(shí)對葡萄球菌、鏈球菌有部分抑制能力;對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用較弱,MIC分別為0.500 g/mL,0.250 g/mL。

表4 3種參多糖對4種細(xì)菌的最低殺菌濃度(MBC)(g/mL)

由表4可知,西洋參多糖在0.125 g/mL時(shí)幾乎能夠殺死大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、支原體和鏈球菌;山參多糖濃度為0.125 g/mL時(shí)能殺死支原體和大腸桿菌,對鏈球菌、金黃色葡萄球菌的MBC組為0.250 g/mL;而三七參多糖效果相對較差,對鏈球菌的MBC為0.500 g/mL。

3 討論

人參多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用,對特異性免疫和非特異性免疫均有一定的促進(jìn)作用,巨噬細(xì)胞是機(jī)體非特異性免疫的關(guān)鍵細(xì)胞,它承擔(dān)著攝取處理和提呈抗原的重要作用,并直接對靶細(xì)胞產(chǎn)生特異性的殺傷作用[7]。巨噬細(xì)胞表面有多種介導(dǎo)細(xì)胞間相互作用的受體,而多糖能通過多糖受體使巨噬細(xì)胞活化[8],激活的巨噬細(xì)胞可以增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的免疫生物學(xué)活性從而達(dá)到抗菌消炎、抗內(nèi)毒素、抗腫瘤,還有促進(jìn)機(jī)體免疫中都有重要作用。

細(xì)胞增殖試驗(yàn)是測定免疫細(xì)胞功能的方法之一,淋巴細(xì)胞受到各種因子刺激時(shí)會(huì)發(fā)生細(xì)胞增殖。在細(xì)胞增殖過程中細(xì)胞的代謝處于旺盛狀態(tài)。細(xì)胞增殖需要大量的能量,以供合成各種大分子物質(zhì)和完成分裂過程,因此細(xì)胞能量代謝的水平往往可以間接反映細(xì)胞增殖情況,Mosmann根據(jù)這一原理首創(chuàng)了MT T比色分析方法[9]。小鼠T淋巴細(xì)胞未經(jīng)ConA刺激時(shí)處于Go期(靜止期),ConA可以誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞表達(dá)IL-2受體,使T淋巴細(xì)胞活化;也可以使T淋巴細(xì)胞從Go期進(jìn)入G1期(DNA合成前期)。LPS是B細(xì)胞的分裂原,直接刺激B細(xì)胞發(fā)生有絲分裂為B細(xì)胞的多克隆激活劑[10]。據(jù)梁中琴等[11]報(bào)道靈芝多糖能刺激人外周血淋巴細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期并可使CD4+細(xì)胞數(shù)量明顯升高,CD4+/CD8+細(xì)胞比例增加。林志彬[12]研究表明,靈芝多糖可通過間接激活淋巴細(xì)胞中的DNA多聚酶促進(jìn)DNA合成及T淋巴細(xì)胞增殖。本研究試驗(yàn)結(jié)果表明:不同產(chǎn)地人參多糖對未經(jīng)ConA或LPS刺激的靜息期細(xì)胞沒有明顯的促增殖作用,然而對ConA活化的小鼠T淋巴細(xì)胞能促進(jìn)增殖,表明兩者有協(xié)同作用,同樣對于LPS激活的B淋巴細(xì)胞同樣能促進(jìn)細(xì)胞增殖。提示人參多糖對T、B淋巴細(xì)胞均具有促進(jìn)有絲分裂的作用是一種理想的免疫刺激劑。

支原體、鏈球菌、大腸桿菌及金黃色葡萄球菌幾乎存在于所有的哺乳動(dòng)物體內(nèi),特別是畜禽類,可以導(dǎo)致各種疾病。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明,不同種屬的人參多糖都呈現(xiàn)出一定的抗菌和殺菌能力,特別是西洋參多糖具有較強(qiáng)的抑菌能力和殺菌能力,對于其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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