子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮中幾種因子的變化

趙樹臣,張冬波,侯振中

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030)

奶牛子宮內(nèi)膜炎是奶牛的常發(fā)疾病,它可推遲繁殖計(jì)劃和降低產(chǎn)奶量,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于炎癥的發(fā)生,其炎性產(chǎn)物和細(xì)菌毒素對子宮黏膜的損害,引起子宮黏膜的炎癥病理變化,這其中有大量的細(xì)胞因子參與,同時會產(chǎn)生大量的自由基。子宮炎癥細(xì)胞產(chǎn)生的大量氧自由基有抑菌、殺菌作用,可防止病原體的進(jìn)一步侵襲。但氧自由基過度聚集卻能降低子宮的免疫細(xì)胞功能。因而進(jìn)行本試驗(yàn)為了闡明發(fā)生子宮內(nèi)膜炎后子宮內(nèi)抗氧化系統(tǒng)和細(xì)胞因子間的變化情況,探討子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 723型可見光分光光度計(jì)、FJ-2008P全自動放射性計(jì)數(shù)儀、電子天平、冰箱、恒溫水浴箱、旋渦混勻器、組織勻漿器等。SOD、GSHPx、MDA、NO試劑盒購自南京建成生物工程研究所,IL-2、IL-6、IL-8及 TNF-α放免試劑盒購自北京科美東雅生物技術(shù)有限公司。

1.2 樣本采集與制備 在哈爾賓市一大型屠宰廠收集臨床處于間情期的淘汰奶牛子宮樣品85例,年齡5～9歲。屠宰后立即采取奶牛生殖器官,觀察子宮頸口、子宮內(nèi)分泌物,顏色、性狀等情況。按照Dohmen M等[1]建立的子宮內(nèi)膜炎分類標(biāo)準(zhǔn),將其分為3組,A組(有黏液和膿液,但膿液少于一半)25例;B組(內(nèi)含大量膿液,且呈黃褐色,有充血)21例;C組(出血、壞死嚴(yán)重,有腐臭味)20例,患子宮內(nèi)膜炎奶牛標(biāo)本66例。對照組為正常子宮樣品19例。

取子宮內(nèi)膜組織塊(0.2～1.0 g)用冷生理鹽水沖洗血液,濾紙吸干,電子天平稱重后制成10%勻漿液,低溫離心機(jī)4000 r/min離心 15 min,取上清液,進(jìn)行各指標(biāo)的測定。

1.3 子宮勻漿中SOD、GSH-Px、MDA、NO 的測定

采用分光光度法,按試劑盒規(guī)定方法測定,并按所給公式計(jì)算測定結(jié)果。

1.4 子宮勻漿中細(xì)胞因子 IL-2、IL-6、IL-8及TNF-α的測定 采用放射免疫分析法。標(biāo)準(zhǔn)曲線以Log(B/B0%)為縱坐標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的 Log(C)為橫坐標(biāo),在Logit-Log坐標(biāo)紙上繪制Log(B/B0%)=A+B Log(C)一次函數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品B/B0%,從標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣品的含量。B/B0%=

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 子宮勻漿中 SOD、GSH-Px、MDA、NO 含量() 見表 1。

表1 子宮勻漿中 S OD、GSH-Px、MDA、NO 含量 ()

表1 子宮勻漿中 S OD、GSH-Px、MDA、NO 含量 ()

a:顯著性差異,P＜0.05;b:極顯著性差異,P＜0.01

組別 例數(shù) SOD(U/mgprot) GSH-Px(U/mgprot) MDA(nmol/mgprot) NO(nmol/mgprot)A 組 25 52.158±7.496 86.928±6.890 0.501±0.095a 0.444±0.117 B組 21 37.480±4.606a 84.511±11.775 0.736±0.111b 0.639±0.133a C組 20 36.048±3.796a 51.281±7.297b 1.055±0.373b 1.246±0.350b對照組 19 49.119±5.340 90.778±9.018 0.293±0.078 0.367±0.095

2.2 IL-2、IL-6 、IL-8、TNF-α標(biāo)準(zhǔn)曲線 IL-2 標(biāo)準(zhǔn)曲線:Log(B/B0%)=0.83-0.02 Log(C),R=0.9992;IL-6標(biāo)準(zhǔn)曲線:Log(B/B0%)=5.02-0.76 Log(C),R=0.9971;IL-8標(biāo)準(zhǔn)曲線:Log(B/B0%)=0.87A-0.18 Log(C),R=0.9958;TNF-α標(biāo)準(zhǔn)曲線:Log(B/B0%)=1.17-0.83 Log(C),R=0.9999。

2.3 子宮勻漿中 IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α的含量見表2。

3 討論

IL-2主要由Th1細(xì)胞產(chǎn)生,具有廣譜免疫增強(qiáng)活性,可誘導(dǎo) T細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)NK細(xì)胞和LAK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子,活化巨噬細(xì)胞[2]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,與對照組比較,A組、B組、C組IL-2含量極顯著性增高(P＜0.01)。但患子宮內(nèi)膜炎A、B、C 3組炎癥愈嚴(yán)重,IL-2水平愈顯下降,可能原因是:一方面是因?yàn)榛甲訉m內(nèi)膜炎奶牛免疫功能障礙,Th1水平低致IL-2分泌下降;另一方面,感染激活了T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,進(jìn)而表達(dá)并釋放IL-2R增加,消耗了大量的IL-2,IL-2水平下降。IL-6主要是由巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生的一種糖蛋白,是炎癥細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成分,與感染性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3]。Ishikawa Y等[4]報道,生產(chǎn)乳牛外周血液中產(chǎn)前IL-6含量普遍高于產(chǎn)后,產(chǎn)前IL-6水平過高,預(yù)示乳牛產(chǎn)后易患子宮內(nèi)膜炎。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,與對照組比較,A組、B組IL-6含量極顯著性增高(P＜0.01),C組IL-6含量顯著性增高(P＜0.05)。說明組織中高表達(dá)的IL-6有助于局部炎癥的發(fā)展。IL-8是一種中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞以及嗜堿性粒細(xì)胞的趨化因子,它能提高嗜中性粒細(xì)胞在炎癥部位的結(jié)合能力,從而增強(qiáng)白細(xì)胞的粘附和移行,還可造成多種炎癥介質(zhì)的釋放,在炎癥反應(yīng)中起重要作用。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,與對照組比較,B組IL-8含量極顯著性增高(P＜0.01),A組、C組IL-8含量顯著性增高(P＜0.05),可能是當(dāng)患有奶牛子宮內(nèi)膜炎時,病原微生物刺激子宮系統(tǒng)中多種細(xì)胞釋放各種細(xì)胞因子,這些細(xì)胞因子能刺激子宮內(nèi)膜中的內(nèi)皮細(xì)胞、單核-吞噬細(xì)胞等分泌 IL-8。TNF亦是一種細(xì)胞因子,可提高粒細(xì)胞的吞噬能力,Fumuso E等[5]報道,在易患產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎和對產(chǎn)后繁殖疾病抵抗力強(qiáng)的母馬子宮活組織檢查中發(fā)現(xiàn)TNF-αmRNA前者與后者相比呈高度表達(dá)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,與對照組比較,A組 TNF-α含量差異不顯著,B組TNF-α含量顯著性增高(P＜0.05),C組TNF-α含量極顯著性增高(P＜0.01)。

表2 各組中子宮內(nèi)膜IL-2、IL-6、IL-8和TNF-α的含量()

表2 各組中子宮內(nèi)膜IL-2、IL-6、IL-8和TNF-α的含量()

a:差異顯著,P＜0.05;b:差異極顯著,P＜0.01

組別 例數(shù) IL-2(ng/mL) IL-6(ng/mL) IL-8(ng/mL) TNF-α(ng/mL)A 組 25 0.941±0.289b 0.372±0.071b 0.085±0.007a 0.549±0.103 B組 21 0.572±0.093b 0.427±0.083b 0.100±0.016b 0.739±0.136b C組 20 0.409±0.273b 0.323±0.111a 0.075±0.007a 0.648±0.123a對照組 19 0.278±0.142 0.229±0.034 0.067±0.007 0.424±0.135

自由基(free radical,FR)己成為生物學(xué)中一個十分活躍的研究領(lǐng)域,目前的研究表明,自由基介入絕大多數(shù)疾病的病理過程。由本試驗(yàn)結(jié)果可知,與對照組比較,A組、B組GSH-Px活力差異不顯著,C組GSH-Px活力極顯著性降低(P＜0.01);與對照組比較,A組SOD活力變化差異不顯著,B組、C組SOD活力顯著性降低(P＜0.05)。表明奶牛子宮局部的抗氧化酶隨著奶牛子宮內(nèi)膜炎癥的加劇,子宮內(nèi)膜組織中其活性降低,相應(yīng)的子宮內(nèi)膜組織中的MDA含量逐漸增高,抗氧化能力降低。與對照組比較,A組MDA含量顯著性增高(P＜0.05),B組、C組MDA含量極顯著性增高(P＜0.01)。國外學(xué)者[6]報道,患子宮內(nèi)膜炎的阿拉伯純種母馬的血漿和紅細(xì)胞中MDA含量顯著增加,而GSH-Px活性顯著下降,認(rèn)為自由基在子宮內(nèi)膜炎病中起這重要作用,GSH-Px活性的降低是由于強(qiáng)大的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)引起的,和本研究結(jié)果相一致。與對照組比較,A組NO含量差異不顯著,B組NO含量顯著性增高(P＜0.05),C組NO含量極顯著性增高(P＜0.01),表明NO也參與該炎癥過程,而且隨著炎癥程度的增加,其含量也增加。Alghamdi A S等[7]也曾報道,人工誘導(dǎo)的患子宮內(nèi)膜炎的母馬子宮分泌物中NO含量比正常者顯著升高,活組織檢查中NOS高度表達(dá)。

本結(jié)果初步表明,在子宮內(nèi)膜炎發(fā)展過程中,各種細(xì)胞因子均有不同程度的升高,參與機(jī)體的炎癥反應(yīng),同時氧自由基也參與了致病過程,這很可能是子宮內(nèi)膜炎發(fā)病后的重要機(jī)制。

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