出入境口蹄疫檢測方法的比較

王玉玲,趙祥平,王國柱,陳本龍,劉紅梅,柴銘駿,楊新梅

(1.天津出入境檢驗檢疫局,天津 塘沽 300461;2.河北出入境檢驗檢疫局,河北 廊坊 050051)

2009年4月,我國首次從烏拉圭進口種牛,依據(jù)雙邊簽訂的檢疫和衛(wèi)生要求議定書,須進行口蹄疫的檢疫。議定書中規(guī)定,在農(nóng)場檢疫和隔離檢疫期間對動物逐頭進行口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白檢測,若在口蹄疫的非結(jié)構(gòu)蛋白檢測中發(fā)現(xiàn)有陽性動物,則立即從牛群中剔除,并對這些陽性動物進行病毒分離試驗,如仍為陽性,則立即停止向中國出口活牛。經(jīng)過中烏雙方協(xié)商,在產(chǎn)地檢疫時,對該批種牛采用世界衛(wèi)生組織(WHO)PANAFTOSA實驗室提供的FMD非結(jié)構(gòu)蛋白檢測系統(tǒng),先用口蹄疫3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白抗體間接ELISA檢測方法篩選,對篩選出的陽性和可疑樣品再用酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印跡試驗(enzyme-linked immunotransfer blot,EITB),進行確認。在進境隔離檢疫時,對該批種牛采用了同樣的方法進行檢測,同時我們還對口蹄疫其他檢測方法進行了應(yīng)用研究,以期尋求到在出入境檢疫或臨床檢疫中更為有效的、操作更為簡便的口蹄疫檢疫方法。

1 材料與方法

1.13 ABC非結(jié)構(gòu)蛋白抗體間接ELISA試驗 用巴西PANAFTOSA實驗室提供的口蹄疫3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白間接ELISA試劑盒,對3955份種牛血清樣品進行檢測。方法按照試劑盒說明書操作。

1.2 酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印跡試驗 用巴西PANAFTOSA實驗室提供的EITB試劑盒,對1.1試驗中陽性的血清樣品進行口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC、3D、2C、3B、3A的EITB檢測。方法按照試劑盒說明書操作。

1.33 ABC非結(jié)構(gòu)蛋白抗體阻斷ELISA試驗 用荷蘭Cedi生產(chǎn)的口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC阻斷ELISA試劑盒,對1.1試驗中陽性的血清樣品進行檢測。方法按照試劑盒說明書操作。

1.4 實時熒光RT-PCR試驗 用深圳太太基因工程有限公司生產(chǎn)的口蹄疫病毒通用型實時熒光RTPCR檢測試劑盒,對1.3試驗為陽性的種牛采集抗凝血進行檢測。方法按照試劑盒說明書操作。

2 結(jié)果與分析

2.13 ABC非結(jié)構(gòu)蛋白抗體間接ELISA試驗

3955份樣品中,95份為陽性反應(yīng),陽性百分率為2.4%。在烏拉圭農(nóng)場檢疫和隔離檢疫時,陽性百分率分別為4.5%和0.9%,說明在國內(nèi)隔離檢疫時3ABC間接ELISA試驗的陽性百分率,與國外檢疫時的基本相符(見表1)。

表1 巴西口蹄疫檢測試劑盒的檢測結(jié)果

2.2 酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印跡試驗 對2.1中篩選出的95份陽性血清樣品進行EITB檢測,結(jié)果(見表2)是95份樣品均為EITB試驗陰性,依此最終判定95份樣品為口蹄疫陰性。說明2.1中篩選的95份為口蹄疫非特異性反應(yīng)。

2.33 ABC非結(jié)構(gòu)蛋白抗體阻斷ELISA試驗 對2.1中篩選出的95份陽性血清樣品進行口蹄疫3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白阻斷ELISA檢測,結(jié)果有1份樣品(樣品號為42)為陽性反應(yīng),其余94份樣品為陰性反應(yīng)。

2.4 實時熒光 RT-PCR試驗 對42號動物采集抗凝血,同時采集了19頭種?？鼓?進行口蹄疫實時RT-PCR檢測,結(jié)果是42號樣品和另外19份樣品均為陰性。該19份樣品為巴西PANAF TOSA 3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白間接ELISA陽性,荷蘭Cedi口蹄疫3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白阻斷ELISA陰性。結(jié)果說明,荷蘭Cedi ELISA檢測的結(jié)果與RT-PCR符合率較高。

3 討論

圖1 口蹄疫實時熒光RT-PCR檢測結(jié)果

3.1 口蹄疫的實驗室診斷方法主要有病原鑒定和血清學(xué)試驗,病原鑒定主要有病毒分離、免疫學(xué)方法和核酸識別方法,血清學(xué)試驗主要有病毒中和試驗、ELISA、EITB試驗[1]。病毒分離及病毒中和試驗都需要用到口蹄疫病毒毒株,需在許可的具有資質(zhì)的生物安全三級實驗室進行,此類試驗的應(yīng)用受到限制。免疫學(xué)方法在病原鑒定時由于涉及到樣品采集的限制也很少被采用?；诖?我們主要對核酸識別方法、ELISA和EITB在實際檢測中進行了應(yīng)用研究。目前在口蹄疫出入境檢疫或臨床檢疫時,通常是先采用血清學(xué)試驗進行檢測,出現(xiàn)陽性結(jié)果的樣品再采用病原鑒定的方法進一步確診。

3.2 從表1中可以看出,不論是在國內(nèi)隔離檢疫還是在國外農(nóng)場檢疫和隔離檢疫,用3ABC間接ELISA篩選出的陽性樣品,經(jīng)EITB確認后均為陰性,說明巴西PANAFTOSA的3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白間接ELISA試劑盒的假陽性率較高。

表2 EITB檢測結(jié)果

EITB是將 3ABC、3D、2C、3B、3A 蛋白固定在硝化纖維素條帶上,當血清樣品中有特異抗體時,產(chǎn)生抗原抗體免疫復(fù)合體,與結(jié)合物結(jié)合后,加入底物發(fā)生顏色反應(yīng),與弱陽性對照上條帶比對,如果在3ABC、3D、3B、3A 處都產(chǎn)生條帶,且顏色等于或深于弱陽性對照時,判定該樣品為EITB陽性。

由于EITB是一種免疫印跡試驗,其結(jié)果比3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白間接ELISA方法更加準確。在南美被廣泛應(yīng)用的血清學(xué)檢測體系時,先用3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白間接ELISA進行口蹄疫篩選試驗,然后用EITB作確認試驗。但EITB操作較復(fù)雜,判定結(jié)果時需眼觀判定,受主觀因素影響較強。

3.3 從荷蘭Cedi 3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白阻斷ELISA檢測的結(jié)果看,95份樣品中只有1份為陽性反應(yīng),94份均檢測為陰性,說明該試劑盒假陽性反應(yīng)較少。據(jù)文獻報道[2],對市售的 UBI、Chekit、Cedi三種ELISA非結(jié)構(gòu)蛋白試劑盒進行比對,結(jié)果說明荷蘭Cedi 3ABC阻斷ELISA的特異性和敏感性是最高的,與疫苗中殘留的非結(jié)構(gòu)蛋白的反應(yīng)也是最低的。通過試驗結(jié)果說明,荷蘭Cedi3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白阻斷ELISA檢測的結(jié)果最符合種牛機體口蹄疫感染的實際情況。建議在出入境檢疫或臨床檢疫中可將荷蘭Cedi 3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白阻斷ELISA作為首選的口蹄疫血清學(xué)檢測方法。

3.4 通過2.4試驗結(jié)果可以看到,42號和另外采集的19份抗凝血樣品均為 RT-PCR陰性,與流行病學(xué)觀察的結(jié)果相符(經(jīng)臨床觀察,20頭牛健康狀況良好,無任何疾病癥狀)。有文獻證明[3],實時RT-PCR的敏感性可比得上病毒分離。通過實際應(yīng)用,實時熒光RT-PCR不涉及到口蹄疫病毒毒株,且方法快速簡便,敏感性和特異性較高,可用于臨床檢疫中的口蹄疫病原鑒定。建議對血清學(xué)檢測為抗體陽性的動物采用實時熒光RT-PCR方法進行口蹄疫病原檢測。

[1] OIE.Man ual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals[EB/O L].http://ww w.oie.in t/en_index.h tm,2009-8-26.

[2] Chen S P,Ellis T M,Lee M C,et al.Com parison of sensitivity and specificity in th ree commercial foot-and-mouth disease virus non-structu ral protein E LIS A kits with sw ine sera in Taiw an[J].Vet Microbiol,2007,119(2-4):164-172.

[3] Reid S M,G rierson S S,Ferris N P,et al.Evaluation of automated RT-PCR to accelerate the laboratory diagnosis of footand-m ou th disease virus[J].J Virol M ethods,2003,107(2):129-139.