RAPD和SRAP分子標(biāo)記在繡球菌菌種鑒定中的應(yīng)用*

陳瑞鵬，賈小寧，郭立忠

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院山東省應(yīng)用真菌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109）

繡球菌 (Sparassis crispa)屬于非褶孔菌目、繡球菌科、繡球菌屬[1]，稱繡球覃。子實(shí)體中等至大形，肉質(zhì)，形似巨大的繡球，直徑10 cm～40 cm，白色至污白或污黃色。孢子無色，光滑，卵圓形至球形，4 μm～5 μm[2]。繡球菌是珍稀名貴的食藥兼用菌，營養(yǎng)特別豐富，在西歐各國極為暢銷，價(jià)格昂貴[3]。繡球菌可提高人體免疫功能，治療心腦血管、糖尿病、高血壓等疾病，長期食用可降低膽固醇、血壓，能清除面部色斑、色素、雀斑、黃斑及嫩膚美容功效[4]。

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD)標(biāo)記技術(shù)和相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）分子標(biāo)記技術(shù)已用于食用菌的菌種鑒定、遺傳育種等研究中。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)成功對(duì)香菇菌株[5]、靈芝[6]、綠僵菌[7]、蜜環(huán)菌[8]等進(jìn)行了遺傳多樣性分析、鑒定和分類。相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記也在銀耳菌[9]、荊半夏[10]、毛木耳[11]等菌株的遺傳多樣性分析中得到廣泛應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)利用RAPD、SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)6個(gè)繡球菌菌株進(jìn)行親緣關(guān)系分析，對(duì)繡球菌遺傳育種工作有重要的實(shí)用價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)材料

供試菌株來源及編號(hào)情況見表1。

表1 繡球菌供試菌株

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 DNA的提取與檢測(cè)

選用新鮮菌絲體作為DNA提取的材料，0.1 g菌絲體于1.5 mL離心管中，液氮研磨。按改良后的CTAB法[12]進(jìn)行DNA的提取，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的基因組DNA的質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 RAPD反應(yīng)引物篩選

64對(duì)引物由上海生物工程公司合成，引物名稱為S3～S6，S8～S21，S23～S28，S31，S32，S34～S42，S44～S50，S120～S130，S380～S384，S386，S388，S390。

64條引物分別對(duì)1號(hào)、3號(hào)、4號(hào)三個(gè)繡球菌菌株基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，篩選合適的引物組合用于遺傳多樣性分析。

PCR反應(yīng)體積 16 μL，各成分終濃度為：1×PCR Bufer，200 μmol·L-1dNTPs，引物各 0.4 μmol·L-1，0.625U TaqDNA聚合酶，5 ng DNA模板，最后加雙蒸水補(bǔ)齊。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性 3 min后，94℃ 30 s，35℃ 30 s，72℃ 3 min，32個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min。

電泳和檢測(cè)統(tǒng)計(jì)：2%瓊脂糖凝膠電泳，恒壓70 V，電泳1 h，于凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)電泳結(jié)果。

2.3 SRAP反應(yīng)引物篩選

應(yīng)用8條上游引物和8條下游引物合成64對(duì)引物，對(duì)1號(hào)、3號(hào)、4號(hào)3個(gè)繡球菌菌株的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，篩選出條帶多、多態(tài)性較好的引物組合用于遺傳多樣性分析，RAPD引物序列編號(hào)及核酸序列情況見表2。

PCR反應(yīng)體積 16 μL，各成分終濃度為：1×PCR Bufer，200 μmol·L-1dNTPs，引物各 0.4 μmol·L-1，0.625U TaqDNA聚合酶，5 ng DNA模板，最后加雙蒸水補(bǔ)齊。循環(huán)體系采用復(fù)性變溫法：94℃預(yù)變性5 min，前5個(gè)循環(huán)（94℃ 1 min，35℃ 1 min，72℃ 1 min），后 35個(gè)循環(huán)復(fù)性溫度提高到50℃，最后72℃延伸10 min。

2.4 親緣關(guān)系鑒定

用篩選出的RAPD、SRAP引物對(duì)6個(gè)繡球菌菌株的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。

2.5 數(shù)據(jù)處理分析

用NTSYS-pc（2.02a）軟件計(jì)算相似性系數(shù)，得相似性系數(shù)矩陣，用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，生成聚類圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 DNA提取結(jié)果

CTAB法提取DNA的檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。

圖1 菌株基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖譜

從圖1可以看出，試驗(yàn)得到了清晰的單一總DNA條帶，能為RAPD、SRAP分子標(biāo)記技術(shù)的PCR擴(kuò)增提供可靠模板。

3.2 RAPD多態(tài)性分析

用篩選的10條隨機(jī)引物（S8、S10、S23、S25、S31、S32、S38、S40、S120、S380）對(duì)6個(gè)菌株的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出257個(gè)條帶，既有共有帶又有特征帶，其中多態(tài)性條帶為245條，多態(tài)性比率為91.4%，每個(gè)引物平均獲得24.5條多態(tài)性條帶。DNA片段分子量大小在250 bp～3000 bp之間。引物S23、引物S32對(duì)供試菌株基因組DNA的擴(kuò)增圖譜見圖2。

圖2 引物S23、引物S32對(duì)供試菌株基因組DNA的擴(kuò)增圖譜

3.3 聚類分析

使用NTSYS(W)202軟件對(duì)6個(gè)菌株的相似性進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3。

圖3 繡球菌菌株的RAPD聚類分析圖

供試的6個(gè)繡球菌菌株經(jīng)RAPD分析表明，兩兩間的相似系數(shù)范圍在0.439～0.981之間，說明其在遺傳上相似程度不同，存在一定的親緣關(guān)系差異。其中菌株4和菌株5的相似性系數(shù)最大為0.981，菌株2和菌株4、菌株5的相似性系數(shù)為所有菌株中較小的為0.393，菌株2和菌株1相似系數(shù)最小為0.383。由圖3可知，相似性系數(shù)0.800時(shí)，6個(gè)菌株聚成4組：1號(hào)、4號(hào)、5號(hào)為1組，3號(hào)、6號(hào)、2號(hào)分別為1組。2號(hào)與其他4株親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

3.4 SRAP多態(tài)性分析

篩選出的 12對(duì)引物（Me6-Em2、Me3-Em3、Me5-Em4、 Me6-Em7、 Me6-Em1、 Me3-Em8、 Me5-Em1、 Me8-Em3、 Me7-Em4、 Me3-Em5、 Me3-Em1、 Me4-Em2），擴(kuò)增6個(gè)供試菌株的基因組DNA，共擴(kuò)增出312條DNA條帶。大部分條帶分子量在200 bp～3000 bp之間，多態(tài)性條帶為246條，占總條帶數(shù)的78.8%，每對(duì)引物平均獲得20.5條多態(tài)性條帶。部分引物的擴(kuò)增結(jié)果見圖4。

圖4 引物Me3-Em3、引物Me6-Em2對(duì)繡球菌菌株DNA的擴(kuò)增圖譜

3.5 SRAP聚類分析

使用NTSYS軟件對(duì)6個(gè)菌株的相似性進(jìn)行聚類分析，分析結(jié)果見圖5。

圖5 繡球菌菌株的SRAP聚類分析圖

供試的6個(gè)繡球菌菌株SRAP分析表明，兩兩間的遺傳相似系數(shù)范圍0.411～0.875，表明菌株間豐富的遺傳多樣性，其中4號(hào)和5號(hào)的相似系數(shù)最大（0.875），親緣關(guān)系最近，2號(hào)和4號(hào)間的相似系數(shù)最?。?.411）。由圖5可看出，當(dāng)相似系數(shù)為0.700時(shí)，可將6個(gè)菌株聚成4組，1號(hào)、4號(hào)、5號(hào)為1組，3號(hào)、6號(hào)、2號(hào)分別為1組。

4 討論

本研究通過SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)繡球菌菌種進(jìn)行分類鑒定，在相似系數(shù)為0.600時(shí)，SRAP標(biāo)記可將6個(gè)供試菌株分為3組。在相似系數(shù)閾值為0.700時(shí)，SRAP標(biāo)記可將6個(gè)供試菌株分為4組。SRAP標(biāo)記在較低的相似系數(shù)水平上，就可將兩親緣關(guān)系較近菌株區(qū)分開來，所反映的遺傳信息豐富，分辨率高且重復(fù)性較好。

研究表明[11]，RAPD可以快速、靈敏、準(zhǔn)確地用于食用菌菌種的檢測(cè)和鑒定。本研究對(duì)64條隨機(jī)引物進(jìn)行篩選，獲得10個(gè)具有多態(tài)性的DNA指紋圖譜，被測(cè)試的6個(gè)繡球菌菌種之間均有遺傳上的差異，且綜合分析，能將所有菌株區(qū)分開來。

通過對(duì)2種分子標(biāo)記技術(shù)的結(jié)果分析，RAPD與SRAP分子標(biāo)記技術(shù)在本實(shí)驗(yàn)中分別在以相似系數(shù)0.8000和0.7000為閾值時(shí)，6個(gè)供試菌株的分組是相同的，都分為4組。4號(hào)、5號(hào)同源性最大，在2種分子標(biāo)記技術(shù)中相似系數(shù)分別達(dá)到了0.9813和0.8750，表明4號(hào)、5號(hào)可能是同物異名，而2號(hào)與4號(hào)相似系數(shù)很低，與其他菌株的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，2種技術(shù)結(jié)果的一致性，證明2種方法能很好地用于繡球菌菌種間親緣關(guān)系的鑒定。

由于缺乏規(guī)范的食用菌品種登記制度，繡球菌菌種同名異物、同物異名的現(xiàn)象普遍存在，這不僅損害了育種工作者和生產(chǎn)者的利益，同時(shí)也加速了菌種的退化，嚴(yán)重阻礙了產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。本試驗(yàn)采用RAPD、SRAP方法篩選出的部分引物能有效地將6個(gè)供試菌株區(qū)分開來，從而為繡球菌菌種鑒定提供了依據(jù)，但對(duì)來源不同的菌種進(jìn)行分析時(shí)，僅依據(jù)一種方法的結(jié)果具有不確定性，如果再結(jié)合子實(shí)體形態(tài)特征和其他的分子檢測(cè)手段進(jìn)行分析，結(jié)果將會(huì)更準(zhǔn)確、更科學(xué)。

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