小鼠骨折愈合過(guò)程中骨痂中FGFRs的表達(dá)

謝楊麗,周銳,易玲嫻,蘇楠,金旻,杜曉蘭,陳林

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所創(chuàng)傷實(shí)驗(yàn)室,骨代謝與修復(fù)中心,創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400042)

骨折愈合是一個(gè)包括軟骨形成,骨形成和重建的復(fù)雜過(guò)程[1]。骨折愈合過(guò)程是局部骨骼的再發(fā)育過(guò)程[2,3]。骨折愈合機(jī)理研究發(fā)現(xiàn),許多參與調(diào)控骨骼發(fā)育的分子如細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)錄因子和基質(zhì)蛋白分子參與了骨折愈合過(guò)程,且這些分子的變化類(lèi)型和規(guī)律與胚胎骨骼發(fā)育過(guò)程中的分子信號(hào)通路變化有較大的相似性。與發(fā)育過(guò)程中相似,成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast grow th factors,FGFs),轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factors,TGFs)和骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)等肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子(heparin-binding growth factors,HBGFs)對(duì)骨折愈合發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[4],并且體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FGF2等具有促進(jìn)骨形成的作用[5]。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(Fibroblast growth factor receptors,FGFRs)是FGFs的特異性受體,提示它們同樣也參與骨折愈合過(guò)程的調(diào)控。既往對(duì)于骨發(fā)育過(guò)程的研究發(fā)現(xiàn),FGFR1和FGFR2主要影響膜內(nèi)成骨過(guò)程,它們的功能增強(qiáng)型點(diǎn)突變均導(dǎo)致囟門(mén)早閉[6],而FGFR3在骨發(fā)育尤其是軟骨內(nèi)成骨中發(fā)揮關(guān)鍵作用,它是骨骼生長(zhǎng)的負(fù)性調(diào)節(jié)分子[7,8]。不同的FGFRs發(fā)揮的作用不同,因此研究其在骨折愈合過(guò)程的表達(dá)對(duì)于明確其在骨折愈合中作用有較大的意義。

我們利用SPF級(jí)C57BL/6J小鼠制作標(biāo)準(zhǔn)骨折模型,組織學(xué)觀察骨折愈合情況及骨折后第3天、第7天、第14天、第21天和第28天FGFRs表達(dá)水平,為研究FGFRs在骨折愈合的作用和尋求改善骨折愈合的方法提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

T rizol(Invitrogen,美國(guó)),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Exscript,TAKARA,日本),定量PCR反應(yīng)試劑盒(SYBRTMPremix Ex TaqTMKit,TAKARA,日本),PCR儀(Eppendorf,德國(guó)),實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Stratagene,美國(guó)),紫外分光光度計(jì)(Eppendorf,德國(guó)),石蠟切片機(jī)(Leica,德國(guó))。

1.2 動(dòng)物模型及分組

2月齡雄性SPF級(jí)C57BL/6J小鼠(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所動(dòng)物中心)50只,體重22-28g,隨機(jī)數(shù)字法分為骨折后3、5、7、14、21 和28天等6個(gè)時(shí)相點(diǎn)組。以Choi[9]等描述的非穩(wěn)定骨折動(dòng)物模型制作方法為基礎(chǔ)改良。使用1%戊巴比妥鈉按1ml/kg劑量腹腔注射,待小鼠完全麻醉后,備皮、消毒小鼠右下肢,在小鼠右側(cè)膝關(guān)節(jié)下切開(kāi)約0.5cm縱行切口,分離肌肉筋膜后,于脛骨中上1/3處用眼科剪橫斷脛骨。逐層縫合切口,制成小鼠右側(cè)脛骨干閉合性骨折模型。

1.3 小鼠骨折愈合情況觀察

術(shù)后清潔環(huán)境下單籠飼養(yǎng),室溫22-24℃,濕度60%,定期紫外線消毒與排風(fēng)。常規(guī)給水及飲食,小鼠可自由活動(dòng)。手術(shù)當(dāng)日,觀察其蘇醒情況。于骨折后5、7、14、21天處死小鼠(n=4),取其骨折脛骨多聚甲醛固定,乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣,梯度乙醇脫水,石蠟包埋,切片厚5 μ m,常規(guī)HE 色,光鏡觀察其組織病理改變。

1.4 總 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄

取各時(shí)間點(diǎn)(n=4)的右側(cè)脛骨骨折處上下各0.3 mm處剪下骨痂,加入液氮待組織變脆后研磨至粉末加入1ml T rizol中,樣品體積不應(yīng)超過(guò)T rizol體積 10%.靜置 10 min;加 200 μ l氯仿混勻 、離心、取上清,異丙醇沉淀,75%乙醇洗滌,用紫外分光光度儀檢測(cè)RNA純度和濃度。OD260/OD280范圍在1.8-2.0之間。取1μ g總RNA為模板,參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取手術(shù)當(dāng)日左側(cè)脛骨同樣位置骨組織提取RNA為對(duì)照。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

內(nèi)參和目的基因的引物由上海生工生物工程公司合成(表一)。PCR反應(yīng)體系配制及擴(kuò)增條件設(shè)置參照定量PCR反應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,每次做3個(gè)復(fù)孔,每個(gè)基因重復(fù)3次。擴(kuò)增條件:95℃30s;95℃5s,57℃20s,72℃15s,40個(gè)循環(huán)(擴(kuò)增);95℃30s,57℃30s,95℃30s。定量PCR儀自動(dòng)給出熔解曲線分析,得到擴(kuò)增曲線、熔解曲線和樣本的循環(huán)閾值(cycle threshold,CT)值和目的基因的相對(duì)含量。

表1 目的基因引物序列Fab.1 primens used in real-time pcr

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 骨折模型制作成功

骨折小鼠麻醉后約2-3小時(shí)可完全蘇醒并逐漸恢復(fù)正?；顒?dòng),傷側(cè)肢體大約在術(shù)后3-5天方可承重。小鼠可自由飲水、飲食及活動(dòng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后成活率為100%,取材前X光攝片,初步觀察骨折愈合,取對(duì)合良好、無(wú)明顯錯(cuò)位和骨碎片的(圖1)40只進(jìn)入結(jié)果分析。

圖1 脛骨骨折X光Fig.1 X-ray images of Tibia fracture

2.2 骨折愈合情況評(píng)價(jià)

骨折后5天,骨痂中主要是軟骨組織,以尚未成熟的靜息期、增殖期軟骨為主(圖2A、E)。骨折后7天,骨痂主要由軟骨性骨痂及少量骨性骨痂組成,其中軟骨痂內(nèi)軟骨組織與第5天比有明顯增多,骨折線周?chē)攒浌羌?xì)胞為主,局部開(kāi)始出現(xiàn)肥大軟骨細(xì)胞(圖2B、F)。骨折后14天,骨痂進(jìn)入硬骨痂形成期,骨痂中大部分區(qū)域被新生編織骨取代,軟骨組織明顯減少,殘留的軟骨組織中軟骨細(xì)胞基本上都已經(jīng)分化為肥大軟骨細(xì)胞(圖2C、G)。骨折后21天,骨痂處于重建階段,軟骨痂基本被編織骨替代,并且開(kāi)始形成骨髓腔(圖2D、H)。骨折后28天,小鼠骨髓腔完全再通(圖片未顯示)。

2.3 小鼠骨折愈合過(guò)程中FGFRs mRNA表達(dá)水平變化

我們利用定量PCR檢測(cè)了骨折愈合各階段骨痂組織中FGFRs mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,FGFR1骨折后3天開(kāi)始顯著升高,最高在14天時(shí)表達(dá)量達(dá)到對(duì)照的6倍,且持續(xù)到骨折愈合的28天仍處在對(duì)照3.2倍水平(圖3A);FGFR2表達(dá)在骨折后顯著增加,在骨折后7天達(dá)到峰值,約為對(duì)照的2.1倍,骨折后28天恢復(fù)正常水平(圖3B);FGFR3骨折后7天表達(dá)達(dá)到峰值,持續(xù)到骨折后21天仍處在較高水平(圖3C)。

3 討論

骨折愈合過(guò)程包括炎癥期、血腫機(jī)化期、軟骨痂形成期、硬骨痂形成期和骨痂塑型改建期等病理學(xué)過(guò)程。骨折愈合過(guò)程有與骨骼發(fā)育過(guò)程類(lèi)似之處:如骨折穩(wěn)定,骨折處骨髓間充質(zhì)細(xì)胞及骨膜下骨生成細(xì)胞等可直接分化為成骨細(xì)胞,在骨折端內(nèi)外形成骨樣組織并逐漸骨化成新骨,即膜內(nèi)成骨;而在不穩(wěn)定骨折時(shí),骨折斷端間的間充質(zhì)細(xì)胞等先分化為軟骨細(xì)胞,形成軟骨痂,隨后軟骨細(xì)胞增生、成熟肥大、凋亡,在軟骨細(xì)胞成熟肥大的同時(shí)伴有血管長(zhǎng)入,成骨細(xì)胞成骨,逐步替代軟骨,并在破骨細(xì)胞的作用下發(fā)生骨重建,即軟骨內(nèi)成骨。絕大多數(shù)骨折愈合都是兩種成骨模式交織進(jìn)行的,只是穩(wěn)定性骨折以膜內(nèi)成骨為主,非穩(wěn)定性骨折以軟骨內(nèi)成骨為主[10,11]。本實(shí)驗(yàn)采用的是不穩(wěn)定骨折模型,組織學(xué)觀察結(jié)果與上述過(guò)程一致,是一個(gè)軟骨形成和骨形成交織進(jìn)行的過(guò)程。骨折后5天,血腫消失,骨痂中出現(xiàn)明顯的軟骨細(xì)胞,主要以靜息期和增殖期軟骨為主;骨折后7天,骨痂以軟骨痂為主,有少量的骨性骨痂出現(xiàn),局部可見(jiàn)肥大軟骨細(xì)胞;骨折后14天,骨痂中大部分是新生編織骨所形成的硬骨痂,存有少量的軟骨組織;骨折后21天,骨痂進(jìn)入重建期,軟骨組織逐漸消失,骨髓腔也開(kāi)始逐漸恢復(fù)再通。

FGFs/FGFRs信號(hào)通路在骨發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。由于表達(dá)譜和與不同配體的親和力不同,FGFRs在骨發(fā)育中的作用有明顯的分工。FGFR1、FGFR2主要在顱骨成骨細(xì)胞中表達(dá),參與骨形成過(guò)程。FGFR1、FGFR2功能增強(qiáng)型點(diǎn)突變主要由于前成骨細(xì)胞分化加快膜內(nèi)成骨增強(qiáng)進(jìn)一步導(dǎo)致顱縫早閉[6,12]。相反地,FGFR3主要在軟骨形成過(guò)程中表達(dá),其突變能引起異常的軟骨內(nèi)成骨,研究證實(shí),FGFR3是軟骨發(fā)育的負(fù)性調(diào)節(jié)因子[7,13,14]。骨折愈合與骨折發(fā)育過(guò)程相似[15]。這提示我們,不同的FGFR在骨折愈合過(guò)程中發(fā)揮不同的作用。

圖2 脛骨骨折后第 5、7、14、21天骨痂組織學(xué)形態(tài)(上排HE×40,下排 HE×100)Fig.2 HE staining of callus tissues on day 5,7,14,21

圖3 骨折愈合過(guò)程中FGFRs表達(dá)水平變化Fig.3 Temporal expression of FGF receptors in the tibia following surgery

我們應(yīng)用定量PCR檢測(cè)FGFRs在骨折愈合過(guò)程中的表達(dá)情況。我們發(fā)現(xiàn),FGFR1在骨折后3天開(kāi)始顯著升高,骨折后14天達(dá)到峰值并持續(xù)到28天。這點(diǎn)與Nakajima等[16]的結(jié)果相似,FGFR1的表達(dá)從骨折后3天即開(kāi)始升高,這與其在骨骼肌受損后促進(jìn)肌源性細(xì)胞增殖和分化以及優(yōu)先參與骨膜下骨前體細(xì)胞增殖相關(guān)[17]。同時(shí)研究證實(shí),FGFR1與炎癥反應(yīng)有關(guān)[18,19],這也是FGFR1在骨折后早期就出現(xiàn)高表達(dá)的可能原因。隨著骨折愈合過(guò)程的發(fā)展,軟骨痂中的軟骨細(xì)胞不斷成熟形成肥大軟骨細(xì)胞,成骨過(guò)程不斷進(jìn)行,表達(dá)于成骨細(xì)胞和的肥大軟骨細(xì)胞的FGFR1在骨折后14、21天持續(xù)處于高表達(dá),與組織學(xué)的骨折愈合過(guò)程相一致。

FGFR2表達(dá)在骨折后顯著增加,在骨折后7天達(dá)到峰值,而后逐漸恢復(fù)到正常水平,這與其的表達(dá)譜也是相一致的。FGFR2主要在骨膜下的成骨細(xì)胞和軟骨痂的肥大前、肥大軟骨細(xì)胞表達(dá)[20],因此其在骨折后表達(dá)變化不如FGFR1靈敏,在骨折后5天,骨痂中以尚未成熟的軟骨細(xì)胞為主,因此FGFR2的表達(dá)變化不明顯,而在有肥大軟骨細(xì)胞出現(xiàn)的骨折后7天發(fā)生明顯改變,并且由于軟骨細(xì)胞的不斷肥大凋亡被成骨細(xì)胞取代而一直處在較高水平。

與對(duì)照相比,FGFR3骨折后7天、14天表達(dá)達(dá)到峰值,持續(xù)到骨折后21天仍處在較高水平。FGFR3在軟骨發(fā)育中在長(zhǎng)骨的靜息期和增殖期軟骨細(xì)胞表達(dá),然而在骨折愈合中,FGFR3主要在肥大前軟骨細(xì)胞和肥大軟骨細(xì)胞中表達(dá)[21],因此,在有大量靜息期與增殖期軟骨的骨折后5天,并不能檢測(cè)FGFR3表達(dá)的顯著增高,而在肥大前軟骨細(xì)胞和肥大軟骨細(xì)胞較多的骨折后7天、14天高表達(dá),這與組織學(xué)觀察的過(guò)程相吻合。

總之,通過(guò)對(duì)骨折愈合中FGFRs表達(dá)的研究,可望為闡明FGFs/FGFRs在骨折愈合過(guò)程中的可能作用和采取干預(yù)FGFs/FGFRs信號(hào)的措施促進(jìn)骨折愈合,降低骨不連率提供理論基礎(chǔ)。

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